副豬嗜血桿菌云南本地株的分離及鑒定

紀(jì)文清,胡永貴,楊貴樹

(1.墨江縣畜牧獸醫(yī)局畜牧工作站,云南 墨江 654800; 2.云縣畜牧局,云南 云縣 675800;3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,云南 昆明 650201)

副豬嗜血桿菌病是由副豬嗜血桿菌引起的豬的多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎。病豬表現(xiàn)有體溫升高(40℃以上),精神沉郁,食欲下降,呼吸困難,被毛粗亂,皮膚發(fā)紅甚至發(fā)紫,消瘦,呼吸困難,關(guān)節(jié)腫大,跛行等。關(guān)節(jié)腔內(nèi)滲出大量纖維素性液體。該病于 1910年由Glasser首次報(bào)道,因此又稱為格拉斯氏病(Glasser's disease),呈世界性分布,我國也從部分規(guī)?；i場中分離到該病菌[1]。在我國當(dāng)前流行的優(yōu)勢血清型主要為 4、5、12、13型[2,3,4]。

副豬嗜血桿菌通常只感染豬,有較強(qiáng)的宿主特異性,主要通過空氣、豬與豬之間的接觸及排泄物進(jìn)行傳播,傳染源為病豬和帶菌豬。通常情況下,母豬和育肥豬是副豬嗜血桿菌的攜帶者,可影響 2～4周齡豬。主要在斷奶后和保育期間發(fā)病,感染高峰為 4～6周齡的豬。副豬嗜血桿菌病的發(fā)病率為 10% ～15%,嚴(yán)重時(shí)病死率可達(dá) 50%[5]。為預(yù)防該病,國內(nèi)外雖然研制了各種類型的基因工程菌苗與多價(jià)滅活菌苗,但由于副豬嗜血桿菌血清型眾多,各個(gè)地方的流行菌株各不相同,各個(gè)血清型之間的交叉保護(hù)性不高,菌苗的免疫效果并不理想[6],給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。鑒于本省未見該菌分離的相關(guān)報(bào)道,本研究通過對(duì)云南本地流行株進(jìn)行分離鑒定,為該病的防制和進(jìn)一步研究奠定一定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 病料來源

采集于具有副豬嗜血桿菌病典型臨床癥狀的仔豬肺臟。

1.1.2 試劑

葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、木糖、尿素、明膠、過氧化氫等,所有試劑均由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心提供。按常規(guī)方法制備備用。

1.2 試驗(yàn)方法[7]

1.2.1 病原菌分離培養(yǎng)

采用直接分離培養(yǎng)法,將病變肺臟剪斷以新鮮切面在培養(yǎng)基上涂抹一點(diǎn)后,進(jìn)行常規(guī)劃線分離,置 37℃恒溫箱培養(yǎng)24～48 h后,挑取可疑菌落作純培養(yǎng)。挑取純培養(yǎng)物接種在普通瓊脂上,觀察是否生長。同時(shí)挑取純培養(yǎng)菌株接種在鮮血瓊脂上,然后用葡萄球菌在鮮血瓊脂上劃線,觀察有無衛(wèi)星現(xiàn)象。

1.2.2 鏡檢

將分離菌株純培養(yǎng)物直接涂片,革蘭氏染色,鏡檢。

1.2.3 生化試驗(yàn)鑒定

1.2.3.1 糖發(fā)酵試驗(yàn) 將分離菌株按常規(guī)方法分別接種于葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘露糖、木糖培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng) 24～48 h,觀察其對(duì)各種糖的利用情況并記錄結(jié)果。

1.2.3.2 尿素酶試驗(yàn) 將分離菌株劃線接種于尿素酶培養(yǎng)基斜面上,37℃培養(yǎng) 24～48 h,觀察其反應(yīng)情況。培養(yǎng)基變粉紅色至紅色者為陽性反應(yīng),不變者為陰性反應(yīng)[2]。

1.2.3.3 靛基質(zhì)(Imdole)試驗(yàn)(吲哚試驗(yàn)) 將分離菌株接種于蛋白胨水培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng) 72 h后,先加少量乙醚或二甲苯,搖動(dòng)試管以提取和濃縮靛基質(zhì),待其浮于培養(yǎng)液表面后,再沿試管壁緩緩加入Kovacs氏試劑數(shù)滴,在接觸面呈玫瑰紅者為陽性反應(yīng),反之為陰性反應(yīng)。

1.2.3.4 過氧化氫酶試驗(yàn) 將過氧化氫溶液直接加入副豬嗜血桿菌生長的斜面上,觀察氣泡的產(chǎn)生。有氣泡產(chǎn)生為陽性,無氣泡產(chǎn)生為陰性。

1.2.3.5 精氨酸水解酶試驗(yàn) 將細(xì)菌接種于精氨酸水解酶培養(yǎng)基中,細(xì)菌使精氨酸降解為鳥氨酸、氨和二氧化碳,氨使培養(yǎng)基顯堿性。指示劑呈紅色為陽性。

1.2.3.6 X因子、V因子需要試驗(yàn) 挑取純培養(yǎng)菌株接種2%月示瓊脂平板上,再分別貼上浸漬有 X、V、X+V因子的圓形濾紙片。如果只有含 X+V因子的紙片周圍有菌落生長,則表明該菌株既依賴 X因子又依賴V因子。如果只有含V、X+V因子的紙片周圍有菌落生長,則表明該菌株只依賴V因子不依賴 X因子。如果只有含 X、X+V因子的紙片周圍有菌落生長,則表明該菌株只依賴X因子不依賴V因子[8]。

1.2.3.7 氧化酶試驗(yàn) 取潔凈濾紙 1小塊,沾取純培養(yǎng)菌株少許,然后加 1%鹽酸四甲基對(duì)苯二胺或 1%鹽酸二甲基對(duì)苯二胺試劑。細(xì)菌在與試劑接觸 10 s內(nèi)呈深紫色為陽性。為保證結(jié)果的準(zhǔn)確性,分別以銅綠假單胞菌和大腸埃希菌作為陽性和陰性對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)特性

取病變肺臟接種于巧克力瓊脂培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng) 24～48 h后可見有針尖大小、圓形、邊緣整齊、灰白色半透明的小菌落生長。普通瓊脂培養(yǎng)基上不生長。挑取典型菌落接種于鮮血培養(yǎng)基上,同時(shí)在上面接種金黃色葡萄球菌,置 5%～10%CO2培養(yǎng)箱中,37℃培養(yǎng) 24h,發(fā)現(xiàn)越靠近葡萄球菌菌落處,該分離菌菌落生長越大,而越遠(yuǎn)離葡萄球菌菌落處,該分離菌菌落生長越小,甚至無菌落(見圖 1)。

圖 1 鮮血瓊脂培養(yǎng)物

2.2 分離菌株染色鏡檢結(jié)果

挑取純培養(yǎng)后生長出的菌落經(jīng)染色后見到革蘭氏陰性的細(xì)小桿菌。菌體形態(tài)多樣,以纖細(xì)桿狀者居多,間有長而彎曲絲狀菌體,個(gè)別呈兩極濃染的球桿狀(見圖 2)。

圖 2 16×100,巧克力瓊脂培養(yǎng)物,革蘭氏染色

2.3 生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果

分離菌株能發(fā)酵葡萄糖、乳糖,產(chǎn)酸不產(chǎn)氣,不發(fā)酵蔗糖、木糖、甘露醇,不產(chǎn)生靛基質(zhì),不分解尿素,不分解精氨酸,過氧化氫酶陽性,氧化酶陰性。生化試驗(yàn)結(jié)果見表 1。

根據(jù)細(xì)菌的培養(yǎng)特性、鏡檢結(jié)果和生化試驗(yàn)鑒定,該次分離菌株為副豬嗜血桿菌。

3 討論

(1)由于副豬嗜血桿菌有較高的培養(yǎng)要求,其生化實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵是特殊培養(yǎng)基的選擇。血清、NAD等成份的加入可以保證副豬嗜血桿菌的培養(yǎng)成功,但是必須保證加入的成份不改變生化試劑的pH值等生化特性。

(2)X因子是血紅蛋白中的血紅素及其衍生物,含鐵卟啉,121℃高溫下 30min不被破壞,是細(xì)菌合成細(xì)胞色素、細(xì)胞色素氧化酶、觸酶和過氧化物酶等的輔基。嗜血桿菌屬的多數(shù)細(xì)菌生長需要供給X因子,但分離菌株不需要 X因子,與副豬嗜血桿菌相符。V因子為輔酶I即煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD),或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP),是細(xì)菌呼吸過程中起遞氫作用的兩種脫氫輔酶,副豬嗜血桿菌自身不能合成V因子,在分離培養(yǎng)時(shí),培養(yǎng)基中應(yīng)加入V因子。

(3)過氧化氫酶是一種以正鐵血紅素作為輔基的酶,所以測試菌所生長的培養(yǎng)基不可含有血紅素或紅血球。并且在試驗(yàn)中不能使用金屬器具,如鉑耳等。

(4)副豬嗜血桿菌十分脆弱,分離培養(yǎng)菌株在 4℃冰箱中保存 3 d即可死亡。病料中的副豬嗜血桿菌也只能存活6 h,給分離培養(yǎng)帶來一定的困難。因此需在患豬剖殺或死亡后及時(shí)進(jìn)行病原分離。副豬嗜血桿菌在鼻腔和氣管中分離率較高,肺臟中極少分離到。本試驗(yàn)是從具有典型病理變化的肺臟中經(jīng)常規(guī)分離到該病原,由此證明,具有典型病變的肺臟也可作為本病原的分離培養(yǎng)病料。

表 1 副豬嗜血桿菌生化試驗(yàn)結(jié)果

(5)對(duì)于豬的呼吸道疾病,如支原體肺炎、繁殖與呼吸綜合征、豬流感、偽狂犬病和豬呼吸道冠狀病毒等感染時(shí),副豬嗜血桿菌的存在可加劇疾病的臨診表現(xiàn)。另外,一些最新報(bào)道指出,副豬嗜血桿菌可能還是引起纖維素性化膿性支氣管肺炎的原發(fā)因素[9]。

(6)對(duì)于該病的診斷及防治除了要有一套臨床診斷方法外,最重要的是在于平時(shí)采取綜合防制措施:加強(qiáng)生物安全防范意識(shí),規(guī)模化豬場要堅(jiān)持自繁自養(yǎng)、全進(jìn)全出的原則,嚴(yán)格控制人員的流動(dòng),杜絕外來人員的參觀,進(jìn)出物品嚴(yán)格消毒;建立良好的飼養(yǎng)管理環(huán)境,豬舍保持清潔衛(wèi)生,按時(shí)消毒,保持舍內(nèi)通風(fēng);發(fā)病時(shí)要用大劑量抗生素治療,并進(jìn)行全群藥物預(yù)防,控制病原,減少應(yīng)激。

(7)疫苗是預(yù)防副豬嗜血桿菌病最為有效的方法之一,但由于副豬嗜血桿菌具有明顯的地方性特征,而且不同血清型菌株之間的交叉保護(hù)率很低。因此主要用當(dāng)?shù)胤蛛x的菌株制備滅活苗,可有效控制副豬嗜血桿菌病的發(fā)生[10]。

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