潤膚消炎洗劑對特應(yīng)性皮炎皮損定植金黃色葡萄球菌影響的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究

林 穎，梁 潔，陳達(dá)燦，陳淑慧，丁常清

特應(yīng)性皮炎 (AD)的發(fā)病與遺傳因素、免疫功能紊亂和皮膚屏障功能障礙密切相關(guān)，變應(yīng)原、感染可誘發(fā)和加重AD。大量研究表明，金黃色葡萄球菌 (金葡菌)感染參與AD發(fā)病，激發(fā)皮膚炎癥并由微生物的產(chǎn)物釋放大量炎癥因子使皮膚炎癥持續(xù)發(fā)展［1］。潤膚消炎洗劑是陳達(dá)燦教授在長期臨床實(shí)踐中總結(jié)的外用治療AD的中藥驗(yàn)方，療效確切。本研究通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)探討潤膚消炎洗劑對AD皮損定植金葡菌的影響，以初步探討該藥的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2009年5月—2010年5月廣東省中醫(yī)院皮膚科門診AD患者23例，診斷標(biāo)準(zhǔn)采用Hanifin和Rajika AD診斷標(biāo)準(zhǔn)［2］;納入存在左右對稱分布的皮損，且皮損嚴(yán)重程度積分差值＜2分，知情同意的患者;排除:近2周內(nèi)曾服用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、抗生素者，應(yīng)用糖皮質(zhì)激素、鈣調(diào)磷酸酶抑制劑、抗生素外用藥物治療者，以及合并嚴(yán)重內(nèi)科疾病、依從性差而未能完成試驗(yàn)的患者。23例患者中，男13例，女10例;年齡11個月～27歲，平均10.5歲;病程1個月～27年，平均6.75年。

1.2 方法

1.2.1 潤膚消炎洗劑對AD靶皮損和對照皮損金葡菌定植密度影響的研究 采用簡單隨機(jī)化方法，應(yīng)用Excel 2003軟件產(chǎn)生統(tǒng)一的隨機(jī)數(shù)字，按照納入的先后順序獲得相應(yīng)的隨機(jī)數(shù)字，左側(cè) (或右側(cè))上肢 (或下肢)的典型皮損作為治療組靶皮損，對側(cè)相應(yīng)皮損則作為對照組皮損。治療組靶皮損以潤膚消炎免煎中藥洗劑外洗或濕敷，中藥免煎顆粒加入沸水1 000 ml或2 000 ml(根據(jù)免煎顆粒的數(shù)量)，攪拌藥物至完全溶解，待中藥溶液水溫下降至20℃以下外洗治療側(cè)皮損 (有滲液皮疹時(shí)以藥液濕敷15 min)，15 min/次，2次/d，14 d為1個療程。對照側(cè)皮損不給予治療。檢測治療前后治療組靶皮損和對照組皮損中金葡菌的定植密度。

1.2.1.1 皮損取材和細(xì)菌培養(yǎng)方法 取材時(shí)點(diǎn):治療前 (第0天)和治療后 (第14天)。取材部位:同一操作者盡量保持治療前后取材部位一致。取材方法:將75%乙醇消毒后的直徑2 cm(面積4 cm2)鏤空的方形標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格膠片置于治療組靶皮損和對照組皮損上，在鏤空處反復(fù)用經(jīng)無菌0.9%氯化鈉注射液浸濕的無菌棉簽擦拭 (橫向、縱向和斜向各10次)，避免擦到鏤空的范圍以外，最后一次擦拭前盡可能使棉簽干燥，以便收集到更多的細(xì)菌。然后將棉簽投入4 ml 0.9%氯化鈉注射液中，反復(fù)震蕩80次，用接種環(huán)取1環(huán) (5μl)接種于羊血瓊脂平皿培養(yǎng)基中，在35℃有氧環(huán)境下培養(yǎng)24 h。對于不能立即送檢的標(biāo)本，一般可保存在4℃冰箱，1 d內(nèi)接種。

1.2.1.2 細(xì)菌鑒定方法 根據(jù)菌落形態(tài)，選取金黃色有透明溶血環(huán)的菌落行革蘭染色，涂片鏡檢為革蘭染色陽性球菌葡萄狀排列，進(jìn)一步行細(xì)菌鑒定，采用法國生物－梅里埃公司生產(chǎn)的VITEK2細(xì)菌鑒定儀。記錄所有分離出的金葡菌菌落數(shù)，以公式計(jì)算每平方厘米的菌落數(shù)，從而測量出皮損處金葡菌定植密度。皮損表面微生物密度 (CFU/cm2)=每平皿菌落數(shù)×800/4。

1.2.2 潤膚消炎洗劑對金葡菌體外抑菌活性的研究

1.2.2.1 實(shí)驗(yàn)材料 (1)主要儀器:超凈工作臺 (蘇州華科凈化設(shè)備有限公司)，恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱 (型號:ZHWY－2102C，上海智城分析儀器制造有限公司)，壓力蒸氣消毒器(型號:SG41.280，上海醫(yī)用核子儀器廠)，Mueller－Hinton瓊脂 (廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)，9 cm細(xì)菌培養(yǎng)皿 (貨號:TCD1009，廣州潔特生物過濾制品有限公司)，天平 (上海精密儀器有限公司天平儀器廠)，照相機(jī) (型號:DSCT50，SONY公司生產(chǎn))，以及錐形瓶、燒杯、玻棒、EP管、吸頭、水浴鍋、酒精燈、紗布等常用耗材。 (2)主要試劑、質(zhì)控菌株:金葡菌標(biāo)準(zhǔn)株及耐甲氧西林金葡菌 (MRSA，均購自廣州市紅十字會醫(yī)院細(xì)菌室)，金銀花等中藥免煎顆粒 (相當(dāng)于中藥飲片10 g等，由江陰天江藥業(yè)有限公司提供，由廣東省中醫(yī)院購進(jìn))，胰化蛋白胨 (tryptone)、酵母提取物 (yesat estract)、蒸餾水、氫氧化鈉 (NaOH)、pH試紙、無菌0.9%氯化鈉注射液等 (均由南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院饋贈)。1.2.2.2 中藥藥液制備 將金銀花等中藥免煎顆粒按含生藥1 g/ml濃度比例加入蒸餾水，攪拌藥物至完全溶解，配成1:1濃度的中藥藥液，以紗布濾過，放入無菌燒杯中密封，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.3 LB(Luria Bertani)液體培養(yǎng)基制備 取胰化蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化鈉10 g，溶解在蒸餾水中，放入錐形瓶中，加1 mol的NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0，加蒸餾水至1 L，用牛皮紙封口，高壓蒸氣滅菌20 min，放入4℃冰箱中保存。

1.2.2.4 M－H瓊脂平板培養(yǎng)基的制備 使用M－H瓊脂，按商品說明書進(jìn)行配制，pH 7.2～7.4。38 g培養(yǎng)基加入1 L純凈水溶解后高溫滅菌，冷卻至50℃左右，倒入直徑90 mm平皿中，每塊板厚度 (4.0±0.5)mm。瓊脂凝固后用保鮮膜包裹密封，4℃冰箱中保存。

1.2.2.5 菌液制備、使用 將新鮮培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)金葡菌、MRSA單個菌落接種至3～5 ml LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)12 h左右，再按1∶100稀釋再接種于LB培養(yǎng)基中，每個瓊脂平板加入100μl菌液，用玻璃涂棒均勻涂布于瓊脂平板表面。

1.2.2.6 藥敏紙片的制作 紙片取濾紙，用普通的打孔器打成直徑6 mm的圓形小紙片。取200片圓紙片放入清潔干燥的小瓶或小平皿中，以單層牛皮紙?jiān)诨虬?。?jīng)15磅15～20 min高壓滅菌后，置于37℃溫箱或烘箱中數(shù)天，使完全干燥。按每張紙片飽和吸水量為0.01 ml計(jì)，將上述紙片加入配置好的不同濃度中藥藥液中，不時(shí)翻動，使濾紙片將藥液均勻吸凈，一般浸泡30 min即可。

1.2.2.7 貼藥敏紙片的方法 用無菌鑷子將紙片放于涂完菌液的瓊脂平板表面并輕壓，使紙片與培養(yǎng)基表面完全接觸，一旦接觸瓊脂后不得再移動。9 cm平皿以4片為宜。每張紙片間距不少于24 mm，紙片中心距平皿邊緣不少于15 mm。貼完紙片后記錄每個平皿藥敏紙片的名稱。

1.2.2.8 結(jié)果判斷 紙片貼完后，根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會 (NCCLS)要求，將平皿置于35℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h后讀取藥敏結(jié)果。24 h后將平板反轉(zhuǎn)，置于暗色、無反光物體表面上判斷。取直尺從平皿背面測量最接近的整數(shù)毫米數(shù)并記錄，以藥敏紙片周圍沒有肉眼可見生長物區(qū)域?yàn)橐志Γ鶕?jù)抑菌圈直徑大小判斷細(xì)菌對抗菌藥的敏感性。有的菌株可出現(xiàn)蔓延生長、輕微生長，進(jìn)入抑菌環(huán)，這些都不作為抑菌環(huán)的邊緣。如果出現(xiàn)低濃度藥物瓊脂平板上不長而高濃度藥物瓊脂平板上生長現(xiàn)象，則應(yīng)檢查培養(yǎng)物純度或重復(fù)試驗(yàn)。

1.2.2.9 對照組設(shè)置 陽性對照組為2%夫西地酸鈉;陰性對照組為0.9%氯化鈉注射液。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。金葡菌定植密度以)表示，兩組間比較采用配對樣本t檢驗(yàn)。p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 潤膚消炎洗劑對AD靶皮損和對照皮損金葡菌定植密度的影響

2.1.1 治療前治療組靶皮損和對照組皮損行金葡菌的鑒定，23例患者中檢出金葡菌14例，占60.9%。因限定納入治療側(cè)(治療組)皮損和對照側(cè) (對照組)皮損嚴(yán)重程度積分差值＜2分，故23例患者治療側(cè)和對照側(cè)檢出金葡菌具有一致性，即對照側(cè)和治療側(cè)均檢出或均無檢出。

2.1.2 治療前后治療組靶皮損、對照組皮損金葡菌定植密度比較 治療前兩組的皮損金葡菌定植密度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05);治療后治療組靶皮損金葡菌定植密度顯著低于對照組皮損，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (p＜0.05，見表1)。

2.1.3 攝像 對本研究中檢出細(xì)菌的AD患者治療前后靶皮損細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行攝像，作為客觀評價(jià)的可循依據(jù)。發(fā)現(xiàn)治療2周后靶皮損金葡菌定植密度較治療前明顯下降 (見圖1、2)。

表1 治療前后治療組靶皮損和對照組皮損金葡菌定植密度比較 (CFU/cm2)Table 1 The comparison of the staphylococcus aureus colonization density between the target lesions and control lesions before and after treatment

圖1 治療前靶皮損檢出的金葡菌Figure 1 Staphylococcus aureus colonization density of the target lesions before treatment

圖2 治療2周后靶皮損檢出的金葡菌Figure 2 Staphylococcus aureus colonization density of the target lesions after treatment

2.2 潤膚消炎洗劑對金葡菌體外抑菌活性的研究結(jié)果

2.2.1 潤膚消炎洗劑對金葡菌體外抑菌情況 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陰性對照組無抑菌作用;潤膚消炎洗劑 (中藥濃度1 g/ml)對標(biāo)準(zhǔn)金葡菌和MRSA均具有抑菌作用，其抑菌作用與陽性對照組 (2%夫西地酸)的抑菌作用有顯著差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (p＜0.01，見表2);即潤膚消炎洗劑組對MRSA抑菌作用較好，而陽性對照組則對標(biāo)準(zhǔn)金葡菌抑菌作用較好。

表2 潤膚消炎洗劑對標(biāo)準(zhǔn)金葡菌和耐甲氧西林金葡菌的體外抑菌情況Table 2 The vitro bacteriostasis of anti－inflammatory moisturizing washing formula for the standard staphylococcus aureus and MRSA

2.2.2 攝像 對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行攝像，作為客觀評價(jià)的可循依據(jù)。發(fā)現(xiàn)濃度1∶1的潤膚消炎洗劑和2%夫西地酸對標(biāo)準(zhǔn)金葡菌及MRSA均有明顯抑菌作用，藥敏紙片周圍可見邊界清楚的透明抑菌環(huán) (見圖3～6)。

3 討論

AD是一種與遺傳相關(guān)的慢性復(fù)發(fā)性炎癥性皮膚病，多發(fā)于兒童和青少年［3］。金葡菌與AD的發(fā)病、病情加重和復(fù)發(fā)關(guān)系密切，它不但使AD的臨床過程復(fù)雜化，更損害皮膚的屏障功能，使皮膚感染持續(xù)和加重。金葡菌可產(chǎn)生多種腸毒素，尤其是金葡菌腸毒素 (SEA、SEB、SEC、SED)及中毒休克綜合征毒素 (TSST)可作為超抗原，刺激T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞活化，促進(jìn)特異IgE分泌，誘發(fā)和加重皮損［4］。

圖3 潤膚消炎洗劑 (濃度1∶1)對金葡菌的抑菌效果Figure 3 The bacteriostasis of the herbal washing formula(herbal concentration retain 1 g/ml)to standard staphylococcus aureus

圖4 2%夫西地酸鈉對金葡菌的抑菌效果Figure 4 The bacteriostasis of 2%fusidic acid to standard staphylococcus aureus

圖5 潤膚消炎洗劑 (濃度1∶1)對MRSA的抑菌效果Figure 5 The bacteriostasis of the herbal washing formula(herbal concentration retain 1 g/ml)to MRSA

圖6 2%夫西地酸鈉對MRSA的抑菌效果Figure 6 The bacteriostasis of 2%fusidic acid to MRSA

潤膚消炎洗劑為陳達(dá)燦教授在長期臨床實(shí)踐中總結(jié)的外用治療AD的中藥驗(yàn)方［5］，以金銀花等中藥共奏潤膚消炎止癢之功。本研究初步探討了潤膚消炎洗劑對AD皮損金葡菌定植密度的影響，發(fā)現(xiàn)用潤膚消炎洗劑治療后AD靶皮損金葡菌定植密度顯著低于對照組皮損，表明潤膚消炎洗劑能有效抑制AD皮膚金葡菌的定植和感染。此外，體外實(shí)驗(yàn)顯示，潤膚消炎洗劑對金葡菌標(biāo)準(zhǔn)株、MRSA的感染有著較好的抑菌作用。因此，抗炎、抑制金葡菌可能是潤膚消炎洗劑起作用的主要機(jī)制之一。

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4 李鄰峰.特應(yīng)性皮炎［M］.北京:北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2006:36－38.

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