精氨酸加壓素對(duì)膿毒癥大鼠的肝腎保護(hù)作用

楊磊 李曉云 柴琛 喬瑋 魯彥 曹農(nóng)

膿毒癥是指局部感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)，運(yùn)用液體復(fù)蘇無(wú)效的頑固性低血壓和器官功能障礙[1]。是嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷、大手術(shù)后、重癥胰腺炎和休克等常見(jiàn)的并發(fā)癥，進(jìn)一步發(fā)展可導(dǎo)致感染性休克、急性呼吸窘迫綜合征和多臟器功能障礙綜合征(MODS)[2]。嚴(yán)重膿毒癥極易誘導(dǎo)繼發(fā)多臟器功能損害，其中內(nèi)毒素通過(guò)腸黏膜屏障進(jìn)入血液是系列病損的始發(fā)點(diǎn)。盲腸結(jié)扎穿孔誘導(dǎo)的膿毒癥易于產(chǎn)生腸道損傷而發(fā)生肝、腎功能的下降。膿毒癥患者死亡的主要原因是頑固性低血壓和多器官功能衰竭[3]。內(nèi)分泌功能異常是膿毒癥的另一重要特點(diǎn)，主要包括腎上腺功能不全和內(nèi)源性精氨酸加壓素(AVP)不足。腎上腺功能不全對(duì)血壓及器官灌注的影響很小。精氨酸加壓素是由下丘腦視上核(SON)和室旁核(PVN)合成分泌的一種九肽激素，其第8位氨基酸是精氨酸，主要儲(chǔ)存在神經(jīng)垂體，其分泌主要受血漿滲透壓、血容量及血壓調(diào)節(jié)。幾乎所有的膿毒癥患者在早期血漿AVP濃度升高，而后期則降低，這一點(diǎn)在膿毒癥動(dòng)物模型中也得到證實(shí)[4～6]。AVP在膿毒癥發(fā)病過(guò)程中的這一變化是否影響器官灌注卻罕見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)盲腸穿刺法(CLP)復(fù)制大鼠膿毒癥模型，探討AVP對(duì)器官灌注的影響，為膿毒癥的治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料與方法

1.材料:(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:清潔級(jí)成年雄性Spargue-Dawley大鼠42只，體重250～300g，購(gòu)自蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。隨機(jī)分組。42只大鼠隨機(jī)分為8組:①假手術(shù)組(n=4);②CLP4 h組(n=6):CLP術(shù)后4h留血清標(biāo)本;③CLP8 h組(n=6):CLP術(shù)后8h留血清;④CLP12h組(n=6):CLP術(shù)后12h留血清標(biāo)本;⑤AVP-i.c.v組(n=6):術(shù)后8h，側(cè)腦室注射AVP(50ng/5μl)0.5h后留血清標(biāo)本;⑥aCSF-i.c.v組(n=4):術(shù)后8h，側(cè)腦室注射人工腦脊液(aCSF)5μl 0.5h后留血清標(biāo)本;⑦AVP-i.v組(n=6):CLP術(shù)后6h靜脈泵入AVP(2ng/kg/h)2h;⑧NS-i.v組(n=4):CLP術(shù)后6h靜脈泵入生理鹽水(NS)2h后留血清標(biāo)本。(2)主要試劑與儀器:精氨酸加壓素(AVP)購(gòu)自Sigma公司;立體定位儀MP-8003購(gòu)自深圳瑞沃德生命科技有限公司;生物信號(hào)記錄系統(tǒng)RM6240系成都儀器廠產(chǎn)品;動(dòng)物呼吸機(jī)(DW-2000型，上海嘉鵬科技有限公司)。(3)藥品配制:靜脈用精氨酸加壓素(5nmol)直接溶解于生理鹽水;側(cè)腦室微量注射用AVP(50ng)直接溶解于人工腦脊液[aCSF(mmol/L):133.3 NaCl，3.4 KCl，1.3 CaCl2，1.2 MgCl2，0.6 NaH2PO4，32.0 NaHCO3，3.4 glucose;pH 7.4]。

2.實(shí)驗(yàn)方法:(1)膿毒癥大鼠模型制備:實(shí)驗(yàn)前12h禁食，自由飲水。按Shi等報(bào)道的方法行CLP致膿毒癥手術(shù)[7]。腹腔注射戊巴比妥鈉(40mg/kg)麻醉后固定，碘伏消毒2遍，鋪無(wú)菌洞巾。沿下腹部腹正中線做1.5cm切口，結(jié)扎盲腸根部(避免結(jié)扎回腸及盲腸系膜血管)，用16號(hào)針頭穿刺盲腸2次，并輕輕擠壓盲腸，直至有少量糞渣流出，然后將盲腸放回腹腔，逐層縫合腹壁切口，假手術(shù)組開(kāi)腹后僅翻動(dòng)盲腸。術(shù)后于腹部皮下注射無(wú)菌生理鹽水(30ml/kg)以補(bǔ)充術(shù)中體液丟失。(2)側(cè)腦室微量注射:側(cè)腦室微量注射參考文獻(xiàn)報(bào)道[8]，腹腔注射(氨基甲酸乙酯800mg:α-氯醛糖40mg:四硼酸鈉40mg/kg)復(fù)合麻醉藥后，大鼠仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)，行氣管插管、右側(cè)股動(dòng)、靜脈和左側(cè)股靜脈插管。動(dòng)脈導(dǎo)管通過(guò)壓力傳感器(P-300B)連接生物信號(hào)記錄系統(tǒng)(RM6240，成都儀器廠)持續(xù)監(jiān)測(cè)機(jī)體BP和HR。氣管插管接動(dòng)物呼吸機(jī)(DW-3000型)通入富含氧氣的空氣(10～12ml/kg，60～70次/分)。根據(jù)大鼠對(duì)疼痛刺激反應(yīng)通過(guò)左股靜脈管補(bǔ)充麻醉藥。大鼠體溫在通過(guò)紅外燈維持37℃。大鼠頭部固定于腦立體定位儀(MP-8003)上，切開(kāi)顱頂皮膚，剝離頂骨骨膜，用浸生理鹽水的棉球壓迫止血。用牙科鉆在前囟后鉆一小孔，參照Paxinos及Watson鼠腦圖譜(Paxinos＆ Watson，2007)，以前囟(bregma)為原點(diǎn)，坐標(biāo)為向后:1.0mm，旁開(kāi):1.5mm，顱骨表面向下:4.5mm。借助立體定位儀將微量注射器插入側(cè)腦。每次注射容量為5μl，給藥時(shí)間超過(guò)30s。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后給藥部位注射膀胺天藍(lán)2μl做組織學(xué)定位，10min后切片做組織學(xué)定位驗(yàn)證。剔除注射部位不在側(cè)腦室的結(jié)果。(3)指標(biāo)及檢測(cè)方法:血漿肝、腎功能檢測(cè):應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀對(duì)留取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血漿進(jìn)行谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(Cr)水平測(cè)定。

結(jié) 果

1.CLP術(shù)后不同時(shí)間大鼠肝、腎功能發(fā)生的變化。與假手術(shù)組相比較，CLP大鼠血漿 ALT、AST、ALP、BUN及Cr隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高，術(shù)后8h開(kāi)始有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;其中，CLP術(shù)后8～12h血漿 ALT、AST、ALP、BUN 及 Cr升高更顯著(表 1)。

表1 CLP術(shù)后不同時(shí)間大鼠肝腎功能的變化

2.CLP術(shù)后8h中樞給予AVP(50ng)肝、腎功能的變化。為了觀察在中樞內(nèi)補(bǔ)充AVP對(duì)大鼠肝、腎產(chǎn)生的影響，我們?cè)贑LP術(shù)后8 h通過(guò)側(cè)腦室注射AVP的方式在大鼠中樞內(nèi)補(bǔ)充AVP，并檢測(cè)大鼠血漿ALT、AST、ALP、BUN 及 Cr。和對(duì)照組比較，側(cè)腦室注射AVP后血漿 ALT、AST、ALP、BUN及 Cr明顯升高(表2)。

表2 CLP術(shù)后8h中樞給予AVP(50ng)肝、腎功能的變化

3.CLP術(shù)后6h靜脈持續(xù)泵入AVP[2ng/(kg·h)]2h肝腎功能的變化。為了觀察持續(xù)通過(guò)靜脈補(bǔ)充AVP對(duì)CLP大鼠肝、腎功能的影響，我們?cè)谠炷：?h開(kāi)始通過(guò)靜脈給藥的方式給大鼠持續(xù)補(bǔ)充AVP[2ng/(kg·h)]2h，給藥后檢測(cè)血漿 ALT、AST、ALP、BUN及Cr的變化。與對(duì)照組比較，靜脈補(bǔ)充AVP 2h后，大鼠血漿 ALT、AST、ALP、BUN 及Cr明顯降低。

表3 CLP術(shù)后6h靜脈持續(xù)泵入AVP[2ng/(kg·h)]2h肝、腎功能的變化

討 論

膿毒癥是機(jī)體對(duì)感染的失控應(yīng)答，即膿毒癥發(fā)病時(shí)，機(jī)體啟動(dòng)應(yīng)答機(jī)制，刺激AVP分泌，膿毒癥早期血漿AVP濃度升高，血壓及器官的灌注維持在正常或稍低水平，隨著膿毒癥病情的進(jìn)展，中樞NO產(chǎn)生增加抑制AVP的表達(dá)，中樞AVP表達(dá)減少，分泌增加，出現(xiàn)AVP的中樞耗竭[9，10]。磁共振檢查發(fā)現(xiàn)在感染性休克病人代表儲(chǔ)存血管加壓素的神經(jīng)垂體T1加權(quán)信號(hào)喪失，說(shuō)明在感染性休克發(fā)生時(shí)，體內(nèi)儲(chǔ)備的血管加壓素迅速耗盡可能是血漿濃度下降的主要原因[11]。膿毒癥后期，因中樞 AVP耗竭導(dǎo)致血漿AVP濃度下降，血壓持續(xù)降低，器官灌注不足。

我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，CLP術(shù)后4h，膿毒癥大鼠肝腎功能維持在接近正常水平，4h以后，膿毒癥大鼠肝、腎功能持續(xù)受損?？赡苁且?yàn)镃LP術(shù)后4h內(nèi)，中樞AVP釋放增加，血漿AVP濃度升高，使血壓能維持在正常水平，器官灌注正常，肝、腎功能未出現(xiàn)明顯受損;CLP術(shù)后4h以后，因中樞AVP耗竭，出現(xiàn)失代償，血漿AVP濃度開(kāi)始降低，因此血壓降低，器官灌注不足，肝、腎功能持續(xù)受損。因此我們?cè)贑LP術(shù)后8h側(cè)腦室微量注射AVP，以期達(dá)到改善因AVP不足引起的低灌流狀態(tài)，然而結(jié)果顯示，側(cè)腦室微量注射AVP后，與對(duì)照組相比，肝、腎功能受損反而加重。其機(jī)制尚不清楚，推測(cè)可能是中樞AVP增加易化皮質(zhì)醇的釋放，膿毒癥時(shí)外周皮質(zhì)醇的增加可促進(jìn)TNF-α的表達(dá)，血漿TNF-α升高進(jìn)一步加重器官損傷，或者CLP術(shù)后8h肝、腎功能因灌注而出現(xiàn)受損，中樞補(bǔ)充AVP后血漿AVP升高，肝、腎的血液灌注有所改善，出現(xiàn)缺血再灌注損傷[12，13]。CLP術(shù)后 6h持續(xù)給予AVP靜脈泵入與對(duì)照組相比可明顯改善肝、腎功能，膿毒癥早期補(bǔ)充外源性AVP可減少中樞AVP的消耗，改善膿毒癥大鼠的血壓，避免器官灌注不足。上述結(jié)果表明AVP對(duì)肝腎功能具有保護(hù)作用，其保護(hù)作用是通過(guò)外周升壓作用，提高器官灌注，從而減輕膿毒癥時(shí)低血壓導(dǎo)致的肝腎功能損害有關(guān)。

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