柴胡揮發(fā)油對(duì)大鼠肝能量代謝的影響

孫 蓉，楊 倩

(1.山東省中醫(yī)藥研究院藥理學(xué)研究室，山東濟(jì)南 250014;2.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟(jì)南 250355)

柴胡揮發(fā)油(volatile oil from Bupleurum chinese)是柴胡的主要解熱、抗炎活性成分，其制劑柴胡注射液和柴胡口服液在臨床應(yīng)用中卻有大量不良反應(yīng)報(bào)道，主要有過(guò)敏反應(yīng)、急性腎衰竭、肺水腫和肝損害等［1－4］。據(jù)制備工藝分析，其不良反應(yīng)的發(fā)生可能與其中所含的柴胡揮發(fā)油有關(guān)。大、小鼠ig給予一定劑量的柴胡揮發(fā)油，肉眼可見(jiàn)肝體積增大、色暗紅、邊緣變鈍等大體病理學(xué)變化［5］。本實(shí)驗(yàn)室既往研究發(fā)現(xiàn)柴胡不同提取物均可造成大鼠肝毒性損傷，氧化應(yīng)激損傷是其重要的損傷途徑［6－8］。本課題研究表明，連續(xù)10 d ig給予大鼠柴胡揮發(fā)油0.25 ～0.50 ml·kg－1可造成大鼠明顯肝毒性損傷，表現(xiàn)為血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(glutamic oxaloacetic transaminase，GOT)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(glutamic pyruvic transaminase，GPT)水平明顯升高，體質(zhì)量明顯降低，肝體比值明顯升高，并呈現(xiàn)明顯的量-效關(guān)系，隨給藥劑量增加上述改變幅度增大［9］。氧化應(yīng)激損傷也是柴胡揮發(fā)油肝毒性機(jī)制之一［9］，氧化應(yīng)激與線粒體功能障礙密切相關(guān)，線粒體既是活性氧產(chǎn)生的主要部位又是活性氧攻擊的首要靶點(diǎn)［10］。且越來(lái)越多的證據(jù)表明，在肝病變過(guò)程中伴隨有線粒體功能和形態(tài)的改變［11］，本文旨在探討柴胡揮發(fā)油對(duì)大鼠肝線粒體能量代謝的影響為闡明其肝毒性機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物

柴胡藥材購(gòu)自河北安國(guó)藥材市場(chǎng)，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)生藥學(xué)專家張芳鑒定為傘形科植物柴胡(B.chinese DC.)的干燥根，經(jīng)檢驗(yàn)為藥典合格藥材。

稱取定量柴胡藥材加12倍量水浸泡15 h，用揮發(fā)油提取裝置加熱回流提取5 h，收集揮發(fā)油(相當(dāng)于生藥量487.39 kg·L－1)置冰箱內(nèi)備用。臨用前加等量吐溫80乳化后加蒸餾水配稀釋至所需濃度。

1.2 試劑與試劑盒

Tris堿購(gòu)自Sigma公司，其他試劑均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司。ATP測(cè)試盒(100T)，批號(hào)均為20080710，購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.3 儀器

DZTW型調(diào)溫電熱套，北京市永光明醫(yī)療儀器廠;T-9601 DDL-5低速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠;UNICO2100紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)美國(guó)尤尼柯(上海儀器有限公司);Clark氧電極，YSI Model 53氧氣調(diào)節(jié)器，美國(guó)金泉(YSI);RF-510LC熒光分光光度計(jì)，日本島津公司;JYD-IA型溶氧測(cè)定儀江蘇江分電分析儀器有限公司。

1.4 動(dòng)物給藥及樣品制備

SPF級(jí)Wistar大鼠，120只，雌雄各半，體質(zhì)量140～190 g，由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(魯)20030004。穩(wěn)定3 d后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)，分別 ig 給予 0.42，0.28，0.19 ml·kg－1的柴胡揮發(fā)油，連續(xù) 15 d，體積均為 10 ml·kg－1，正常對(duì)照組ig給予同體積的蒸餾水。

末次藥后大鼠禁食12 h，眶靜脈叢取血，3000×g離心10 min，處死解剖取肝臟。取1 g肝組織放入預(yù)冷的生理鹽水中洗去污血，用小剪刀于冰浴的小燒杯中將肝組織剪成邊長(zhǎng)為1～2 mm的小塊，加入5 ml預(yù)冷的分離介質(zhì)(蔗糖 0.25 mo1·L－1，Tris-HCl 0.005 mol·L－1，EDTA 0.001 mol·L－1，pH 7.5)，將剪好的組織塊轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的玻璃勻漿器中，上下均勻勻漿10次，勻漿液于4℃條件下12 000×g離心20 min，棄上清，取其沉淀部分即為線粒體，再加入150 μl勻漿遞質(zhì)，用微量勻漿器勻漿，制成線粒體懸浮液。

1.5 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.5.1 肝臟線粒體呼吸耗氧、呼吸控制率、磷氧比值

采用 Clark 氧電極法［12］，取反應(yīng)介質(zhì)(蔗糖0.225 mol·L－1，KCl 15 mmol·L－1，KH2PO415 mmol·L－1，Tris-HCl 50 mmol·L－1，EDTA 1 mmol·L－1，pH 7.5)2.9 ml，加入攪拌反應(yīng)杯中，恒溫30℃。加入線粒體混懸液0.1 ml，以琥珀酸(終濃度 10 mmol·L－1)為底物，反應(yīng) 1min 后加入 ADP 600 nmol·L－1，用 JYD-IA溶氧測(cè)定儀記錄線粒體氧化還原反應(yīng)曲線，計(jì)算呼吸耗氧量、呼吸控制率(respiratory control rate，RCR)和磷氧比值(phosphorus to oxygen index，P/O)。

1.5.2 ATP 含量［13］

將提取的完整線粒體混懸液按1∶1加裂解液混勻，保證線粒體膜可以被完全裂解。裂解后在4℃ 條件下12 000×g離心8 min，取上清，稀釋100倍待測(cè)。ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液用超純水稀釋成0，0.1，1，10和100 nmol·L－1濃度梯度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。加100 μl ATP 檢測(cè)工作液到檢測(cè)管中，在檢測(cè)管中加10 μl樣品，迅速用加樣器混勻，立即用弱光儀檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中的 ATP 含量，以μmol·g－1表示。

1.5.3 ATP 酶活力

定磷法［14］測(cè)定ATP酶活力，ATP酶的活力單位以每小時(shí)每克蛋白分解ATP產(chǎn)生的1 mmol無(wú)機(jī)磷的量來(lái)表示，即 mmol·h－1·g－1蛋白。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 柴胡揮發(fā)油對(duì)大鼠肝線粒體呼吸功能的影響

與正常對(duì)照組比較，柴胡揮發(fā)油0.19，0.28和0.42 ml·kg－1組 RCR，P/O 和呼吸耗氧量均顯著降低，且有隨劑量增加不斷降低的趨勢(shì)(表1)。

表1 柴胡揮發(fā)油對(duì)大鼠肝線粒體耗氧量、呼吸抑制率(PCR)和磷與氧比值(P/O)的影響Tab.1 Effect of volatile oil from B.chinese on the respiratory oxygen uptake，respiratory control rate(PCR)and phosphorus to oxygen index(P/O)of hepatic mitochondrion in rats

2.2 柴胡揮發(fā)油對(duì)大鼠肝線粒體ATP含量的影響

與正常對(duì)照組比較，柴胡揮發(fā)油0.19，0.28和0.42 ml·kg－1組肝線粒體內(nèi) ATP 含量明顯降低，并隨劑量增加逐漸降低(P＜0.05)(表2)。

表2 柴胡揮發(fā)油對(duì)大鼠肝線粒體ATP含量的影響Tab.2 Effect of volatile oil from B.chinese on ATP contents in hepatic mitochondrion of rats

2.3 柴胡揮發(fā)油對(duì)大鼠肝線粒體ATP酶活性的影響

如表3所示，與正常對(duì)照組相比，柴胡揮發(fā)油0.19 ～ 0.42 mg·kg－1顯著降低 Na+-K+-ATP 酶、Mg2+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

表3 柴胡揮發(fā)油對(duì)大鼠肝線粒體ATP酶活性的影響Tab.3 Effect of volatile oil from B.chinese on hepatic mitochondrion activities of ATPases in rats

3 討論

肝是能量代謝的重要器官，含有豐富的線粒體，而線粒體是細(xì)胞有氧呼吸的基地和能量供應(yīng)的場(chǎng)所，細(xì)胞生命活動(dòng)約95%的能量來(lái)自線粒體。肝損傷時(shí)線粒體是較早發(fā)生損害的細(xì)胞器之一，線粒體的呼吸功能以及氧化磷酸化功能受抑制，ATP合成減少，從而必然引起細(xì)胞能量代謝障礙并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

RCR是指ADP控制下的氧消耗速率與不受ADP控制的氧消耗速率的比值，是反映線粒體結(jié)構(gòu)完整性及氧化磷酸化耦聯(lián)程度的靈敏指標(biāo)［15］。P/O是指線粒體每消耗一摩爾氧原子時(shí)有多少摩爾的ADP磷酸化成ATP，反映了線粒體利用氧化釋放的能量來(lái)合成ATP的效率［15］。ATP作為機(jī)體內(nèi)各種生理活動(dòng)最直接的供能物質(zhì)，它的產(chǎn)生依賴于ATP酶的活性。Na+-K+-ATP酶是維持線粒體膜流動(dòng)性正常的關(guān)鍵酶，Ca2+-ATP酶、Mg2+-ATP酶是維持細(xì)胞內(nèi)鈣鎂平衡的重要物質(zhì)，Mg2+/Ca2+比值是反映細(xì)胞不可逆損傷的重要指標(biāo)［15］。本文研究結(jié)果表明，連續(xù)15 d給大鼠ig給予不同劑量的柴胡揮發(fā)油，肝線粒體PCR、P/O、呼吸耗氧量、ATP含量和ATP酶活性均明顯降低。提示柴胡揮發(fā)油通過(guò)降低肝線粒體氧化磷酸化效率、減少ATP合成，從而使ATP酶功能不足，ATP酶活性降低致線粒體膜流動(dòng)性降低、結(jié)構(gòu)受損，從而造成肝細(xì)胞的不可逆損傷。

通過(guò)本研究可確認(rèn)抑制肝線粒體呼吸功能、影響肝能量代謝是柴胡揮發(fā)油致大鼠肝毒性損傷的一條途徑，因此，有必要對(duì)其可能存在的其他肝毒性機(jī)制進(jìn)行研究，為闡明柴胡揮發(fā)油的肝毒性以及保證臨床安全應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)也為中藥肝毒性評(píng)價(jià)提供研究思路與技術(shù)支撐。

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