白芍總苷對實驗性關(guān)節(jié)炎大鼠足爪組織基質(zhì)金屬蛋白9表達及關(guān)節(jié)浸液一氧化氮和地諾前列酮水平的影響

李宜川，張玉霞，劉國玲，高明燦，常景芝，陳曉琦

(商丘醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，河南商丘 476100)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以對稱性多關(guān)節(jié)炎病變?yōu)橹鞯娜硌装Y性自家免疫疾病。其顯著的病變以滑膜組織炎癥細胞浸潤、滑膜細胞增生、血管翳形成及軟骨和軟骨下骨質(zhì)破壞為主，最終導(dǎo)致受累關(guān)節(jié)發(fā)生畸形而出現(xiàn)關(guān)節(jié)廢用和致殘。其發(fā)生機制涉及細胞因子、遺傳和感染等多種因素。白芍總苷(total glucosides of paeonia，TGP)是從亳白芍干燥根中提取的有效成分，長期中醫(yī)實驗未發(fā)現(xiàn)TGP對人體有毒性，TGP的動物毒性研究也顯示TGP無明顯毒性損害，安全范圍大［1］。目前有關(guān)RA受損局部組織基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)表達及關(guān)節(jié)浸液炎癥介質(zhì)在RA發(fā)生和發(fā)展過程中的作用受到人們的關(guān)注。本實驗在成功建立大鼠實驗性關(guān)節(jié)炎模型的基礎(chǔ)上，觀察TGP對實驗性關(guān)節(jié)炎即膠原Ⅱ型誘導(dǎo)的實驗性關(guān)節(jié)炎大鼠足爪組織MMP-9表達及關(guān)節(jié)浸液中一氧化氮(nitric oxide，NO)，地諾前列酮(前列腺素 E2，dinoprostone，prostaglandin E2，PGE2)含量的影響，從根本上尋求其對實驗性關(guān)節(jié)炎大鼠治療的可能機制，為臨床使用TGP治療RA提供新的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

Sprague-Dawley(SD)大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量(150±20)(±s)g，由商丘醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校實驗動物中心提供，動物合格證號:2009A01。

1.2 藥品與試劑

TGP購自安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所;弗氏完全佐劑、雞膠原Ⅱ型購自上海本草生物醫(yī)學(xué)工程所;多聚賴氨酸購自美國Sigma公司;地塞米松鹽酸注射液購自河南確山龍淵藥業(yè)有限公司;氯化鈉注射液購自石家莊四藥股份有限公司;冰醋酸購自廣州化學(xué)試劑二廠;MMP-9小鼠單克隆抗體免疫組化SP試劑盒購自北京中山公司;NO試劑盒購自南京建成生物工程研究所;PGE2試劑盒購自解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放射免疫研究所。

1.3 實驗性關(guān)節(jié)炎模型的制備及藥物分組

大鼠60只，雌雄各半，隨機分為6組:正常對照組，模型對照組，地塞米松 2 mg·kg－1組，白芍總苷100，50 和 25 mg·kg－1組，每組 10 只。將雞膠原Ⅱ型15 mg 溶于7.5 ml預(yù)先配制好的醋酸0.1 mol·L－1中，濃度為2 mg·kg－1，4℃過夜，充分溶解。次日，與弗氏完全佐劑等體積于冰浴中混合，使之充分乳化，制成穩(wěn)定的乳化劑15 ml，每ml含1.0 g膠原Ⅱ型，置4℃冰箱保存?zhèn)溆?。SD大鼠除正常對照組外，在大鼠的左后肢足跖皮內(nèi)sc給予膠原乳劑0.1 ml致炎，第7天在大鼠尾、背多點sc給予0.1 ml該膠原乳劑作為激發(fā)注射。正常對照組大鼠注射等劑量生理鹽水作為致炎物質(zhì)。操作時，先將注射部位以75%乙醇棉球消毒，然后再進行注射。白芍總苷組大鼠于造模后第7～27天ig給予白芍總苷25，50和100 mg·kg－1;陽性對照地塞米松組大鼠也于造模后第7～27天每天ip給予地塞米松2 mg·kg－1;正常對照組和模型組ig給予等容積生理鹽水。

1.4 體質(zhì)量及關(guān)節(jié)炎指數(shù)［2］測量

致炎前(第0天)及致炎后第7，14，21，28和35天分別測量大鼠體質(zhì)量。同時在致炎后第7天，第14天，第18天，第22天，第26天，第30天和第34天，采用關(guān)節(jié)評分法，得出關(guān)節(jié)炎指數(shù)(arthrits index，AI)，具體評分標(biāo)準(zhǔn)如下:0分，無紅腫;1分，趾關(guān)節(jié)紅腫;2分，趾關(guān)節(jié)和足趾腫脹;3分，踝關(guān)節(jié)以下的足爪腫脹;4分，包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹;每肢AI最高分數(shù)為4分，四肢AI之和代表每只大鼠的AI，最高值為16分。

1.5 免疫組化法測定大鼠足爪組織中基質(zhì)金屬蛋白酶9的表達

實驗第35天采集足跖部位的組織，用4%甲醛及時固定，石蠟包埋，切片，貼片。將切片浸入PBS 0.1 mol·L－1(pH 7.4)浸泡、微波修復(fù)抗原。滴加封閉液羊血清。滴加1∶50的羊抗MMP-9抗體。滴加鏈霉抗生物素-過氧化物酶溶液。滴加鏈霉親和素-生物素(SABC)。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。⑧滴加蘇木素輕度復(fù)染后，依次進行脫水、透明、中性膠封片及顯微鏡觀察。

光學(xué)顯微鏡下觀察，每組隨機計數(shù)500個細胞，以胞漿出現(xiàn)淡黃至褐黃色細顆粒狀著色為陽性細胞，計算陽性百分率。

1.6 硝酸還原法測定關(guān)節(jié)浸液NO含量和放免法測定地諾前列酮含量

大鼠處死后，迅速采集左足腫脹足爪，縱向切開足爪組織，放入5 ml冷生理鹽水中，于4℃浸泡過夜，3200×g離心 10 min，取上清液過濾除菌，－20℃凍存待測。NO含量的測定采用硝酸還原法，PGE2含量測定采用放免法，均按試劑盒說明進行操作。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 白芍總苷對實驗性關(guān)節(jié)炎大鼠體質(zhì)量的影響

與正常對照組相比實驗性關(guān)節(jié)炎大鼠于造模后第7天表現(xiàn)四肢關(guān)節(jié)紅腫、活動量減少、食欲下降、毛發(fā)灰暗無澤和明顯消瘦體質(zhì)量減輕。TGP 50和100 mg·kg－1和地塞米松 2 mg·kg－1可有效緩解 CIA大鼠體質(zhì)量的減輕(表1)。

2.2 白芍總苷對實驗性關(guān)節(jié)炎大鼠多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響

如表2所示，各組大鼠致炎后第l4天開始大鼠多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)升高。與正常對照組相比，CIA模型組各時間點AI有非常顯著性差異(P＜0.01);與CIA模型大鼠相比，白芍總苷50和100 mg·kg－1組及地塞米松組從第18天開始AI有明顯降低(P ＜0.05，P ＜0.01)，白芍總苷25 mg·kg－1組與 CIA模型大鼠相比差異有顯著性(P＜0.05)。

表1 白芍總苷(TGP)對膠原Ⅱ型誘導(dǎo)的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(CIA)大鼠體質(zhì)量的影響Tab.1 Effects of total glucosides of paeonia(TGP)on body mass of rats with arthritis induced by collagen typeⅡ

表2 TGP對實驗性關(guān)節(jié)炎大鼠足爪關(guān)節(jié)指數(shù)(AI)的影響Tab.2 Effect of TGP on arthritis index(AI)in rats with arthritis induced by collagen typeⅡ

2.3 白芍總苷對實驗性關(guān)節(jié)炎大鼠足爪基質(zhì)金屬蛋白酶9蛋白表達的影響

如表3和圖1所示，MMP-9蛋白表達陽性部位主要在細胞漿中，在高倍鏡下可見細胞漿內(nèi)棕黃色染色小顆粒。正常對照組細胞漿內(nèi)未見陽性染色區(qū)域;模型對照組陽性染色細胞明顯，染色程度為棕黃色，MMP-9蛋白表達強陽性;地塞米松陽性對照組胞漿內(nèi)略見棕黃色染色小顆粒，與模型對照組比較有非常顯著性意義;與模型對照組比較，白芍總苷50和100 mg·kg－1組胞漿內(nèi) MMP-9陽性表達細胞百分率明顯降低(P＜0.05，P＜0.01);白芍總苷25 mg·kg－1胞漿內(nèi)陽性表達無顯著性差異。

表3 TGP對實驗性關(guān)節(jié)炎大鼠足爪組織中基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)表達的影響Tab.3 Effect of TGP on MMP-9 expression in paws of rats with arthritis induced by collagen typeⅡby immunohistochemistry

圖1 TGP對實驗性關(guān)節(jié)炎大鼠足爪組織中基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)表達的影響 (HE ×400).動物分組、造模和給藥見表1.A:正常對照組;B:模型對照組;C:地塞米松2 mg·kg－1組;D－F:白芍總苷25，50和100 mg·kg－1.胞漿為淡黃至褐黃色者為MMP-9陽性細胞.Fig.1 Effect of TGP on matrix metalloproteinase 9(MMP-9)protein expression in paws of rats with arthritis induced by collagen typeⅡby immunohistochemistry(HE ×400).

2.4 白芍總苷對實驗性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)浸液內(nèi)一氧化氮和地諾前列酮含量的影響

如表4所示，與正常對照組比較，CIA模型組大鼠關(guān)節(jié)浸液中NO和 PGE2含量明顯增高(P＜0.01);與 CIA 模型組比較，TGP 25，50和100 mg·kg－1組、地塞米松 2 mg·kg－1組治療后關(guān)節(jié)浸液內(nèi) NO和 PGE2含量明顯下降(P＜0.01，P ＜0.05)。

表4TGP對實驗性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)浸液中一氧化氮(NO)和地諾前列酮(PGE2)含量的影響Tab.4 Effect of TGP on the concent of nitric oxide(NO)and dinoprostone(PGE2)in articular infusion of rats with arthritis induced by collagen typeⅡ

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)雞膠原Ⅱ型誘導(dǎo)的實驗性關(guān)節(jié)炎大鼠模型，原發(fā)病變主要表現(xiàn)為致炎足爪腫脹，繼發(fā)性病變一般于致炎后14 d左右出現(xiàn)，表現(xiàn)為非炎性足爪紅腫、腫脹、耳和尾部出現(xiàn)“關(guān)節(jié)小節(jié)”及體質(zhì)量下降，第22～27天病變達高峰。TGP 25，50和100 mg·kg－1可明顯抑制實驗性關(guān)節(jié)炎大鼠的足爪腫脹和多發(fā)性關(guān)節(jié)炎程度;TGP 50和100 mg·kg－1可促進實驗性關(guān)節(jié)炎大鼠體質(zhì)量的恢復(fù);表明TGP對實驗性關(guān)節(jié)炎大鼠具有明顯的治療作用。

MMPs是一類分解細胞外基質(zhì)組分(除多糖)的鋅蛋白酶，在RA的細胞外基質(zhì)降解中起著重要作用。MMPs水平升高，使得細胞外基質(zhì)成分發(fā)生不可逆降解及關(guān)節(jié)破壞。在MMPs家族中MMP-9是明膠酶，在滑膜組織浸潤的炎癥細胞中表達，包括巨噬細胞、淋巴細胞和肥大細胞等［3］。Ahrens等［4］證實滑膜為MMP-9的產(chǎn)生部位。MMP-9在RA過程中的作用機制可能是:MMP-9不僅被動地作為炎癥反應(yīng)的下游產(chǎn)物而出現(xiàn)，它還對許多促炎因子發(fā)揮正反饋作用，是炎癥反應(yīng)重要的“調(diào)節(jié)劑”［5］。Schonbeck等［6］研究發(fā)現(xiàn)MMP-9可以在白細胞介素1β轉(zhuǎn)換酶作用位點裂解 IL-1，使無活性的前體IL-1β向有活性IL-1β轉(zhuǎn)化。IL-1β是炎癥的始動因素，與關(guān)節(jié)局部炎癥反應(yīng)加重有關(guān)［7］，具有多種促炎活性，能誘導(dǎo)滑膜細胞產(chǎn)生PGE和膠原酶，能上調(diào)其他促炎因子的產(chǎn)生。本實驗研究發(fā)現(xiàn)模型對照組足爪中MMP-9陽性表達率極高，給予TGP治療可顯著抑制實驗性關(guān)節(jié)炎大鼠足爪組織MMP-9的表達，與MMP-9可破壞成熟血管壁的基底膜，從而允許內(nèi)皮細胞的遷移，與血管翳的形成有關(guān)［8］的研究報道相符合。提示TGP可能通過抑制RA滑膜細胞分泌MMP-9，從而可以抑制血管新生，減緩滑膜血管翳形成與增殖而減輕其對關(guān)節(jié)軟骨及骨的侵蝕破壞作用，同時由于MMP-9的表達受到抑制，使得活性IL-1β轉(zhuǎn)化受阻，促炎癥細胞因子、PGE和膠原酶生成減少，關(guān)節(jié)局部炎癥反應(yīng)得到緩解。

NO是一種重要的炎癥介質(zhì)，動物實驗性關(guān)節(jié)炎時，體內(nèi)NO水平異常升高，特別是關(guān)節(jié)浸液中有大量NO［9］，其機制是NO能促進釋放IL-1和TNF-α，而IL-1和TNF-α的異常增高可導(dǎo)致細胞毒性作用，介導(dǎo)免疫損傷，直接或間接刺激滑膜細胞和軟骨細胞合成并釋放PGE2［10］和膠原酶增多形成惡性循環(huán)，引發(fā)滑膜炎癥反應(yīng)，軟骨基質(zhì)崩解，軟骨吸收和骨破壞;同時NO還能影響成纖維細胞樣滑膜細胞誘導(dǎo)產(chǎn)生MMPs，加重關(guān)節(jié)損傷。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，實驗性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)浸液中NO和PGE2含量明顯增高，但TGP治療后實驗性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)浸液中NO和PGE2水平顯著降低，提示NO和PGE2參與了RA的炎癥過程，TGP可通過抑制NO和PGE2的產(chǎn)生，減輕局部炎癥，改善關(guān)節(jié)腫脹、延緩關(guān)節(jié)損傷等癥狀。

TGP對實驗性關(guān)節(jié)炎大鼠的多發(fā)性關(guān)節(jié)炎有明顯的抑制作用，可能是與其下調(diào)MMP-9表達及降低炎癥局部區(qū)域相關(guān)炎癥介質(zhì)NO和PGE2產(chǎn)生，從而抑制滑膜組織增生、關(guān)節(jié)軟骨侵蝕、血管翳生成，減低致炎癥細胞因子含量，使炎癥細胞因子網(wǎng)絡(luò)趨于平衡。

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