D-硝基精氨酸對小鼠腎損傷及氧化應(yīng)激作用

韓 濱，張麗麗，由振強，辛艷飛，陳云祥，陳國燦，徐潘生，陳 穎，宣堯仙

(浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院安全性評價研究中心，浙江杭州 310013)

D-硝基精氨酸(NG-nitro-D-arginine，D-NNA)在體內(nèi)可發(fā)生手性轉(zhuǎn)化，生成L型對映異構(gòu)體，而腎是D-NNA發(fā)生手性轉(zhuǎn)化的主要器官，約有80%的D-NNA在腎發(fā)生手性轉(zhuǎn)化。研究證實，D-NNA手性轉(zhuǎn)化存在兩步反應(yīng)機制:① D-NNA在腎D型氨基酸氧化酶(D-amino acid oxidase，DAAO)作用下氧化脫氨生成α-酮酸;② α-酮酸在轉(zhuǎn)氨酶參與下，通過立體選擇性獲取氨基生成 L-硝基精氨酸(NG-nitro-L-arginine，L-NNA)，實現(xiàn)手性轉(zhuǎn)化［1－4］。D-NNA的手性轉(zhuǎn)化產(chǎn)物 L-NNA是一氧化氮合酶(nitric oxide sythase，NOS)的抑制劑，NOS活性被抑制后，可減少體內(nèi)NO生成，而NO是體內(nèi)一種重要的生物信號分子，具有調(diào)節(jié)血管阻力、血壓、血小板聚集與黏附等多種生物學(xué)作用，NO生成減少會引起動物血壓長時間升高、腎動脈管腔縮小、動脈管壁的局限性壞死和微細血管堵塞，引起多種病理損傷。前期研究還發(fā)現(xiàn)在D-NNA手型轉(zhuǎn)化過程中，會產(chǎn)生大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)，生理狀態(tài)的自由基有刺激細胞生長作用，但是當自由基的產(chǎn)生和清除的平衡狀態(tài)被打破后，自由基大量堆積，會導(dǎo)致氧化應(yīng)激，引發(fā)脂質(zhì)過氧化，形成脂質(zhì)過氧化物，對蛋白質(zhì)、脂肪和核酸均具有損害作用，造成氧化損傷［5］。

ROS和NO減少在腎功能損傷中起重要作用［6－7］。D-NNA在腎手性轉(zhuǎn)化過程中產(chǎn)生的大量ROS和對NOS活性的抑制可能會對腎有損傷作用。為此，本研究通過長期給藥，觀察D-NNA對ICR小鼠腎損傷作用，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

D-NNA購自Bachem Biosciences公司，用5%葡萄糖超聲溶解;NO試劑盒，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)，丙二醛 (malondialdehyde，MDA)，谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)試劑盒，購自南京建成生物工程研究所。全自動血液生化分析儀(Hitachi，日本)。

1.2 動物及分組處理

40只健康ICR小鼠，雄性，體質(zhì)量18～22 g，清潔級，由浙江省實驗動物中心提供。動物合格證號:0010040。飼養(yǎng)于屏障系統(tǒng)動物實驗房內(nèi)，自由飲水攝食，飼料為全價營養(yǎng)顆粒飼料，飲水為城市飲用水經(jīng)LAWS-2000實驗動物反滲透純水機處理。小鼠隨機分為4組，每組10只:5%葡萄糖對照組，D-NNA 150，50 和15 mg·kg－1組，連續(xù) ip 給藥 30 d。給藥結(jié)束次日進行小鼠稱重和所有指標的檢測檢查。

1.3 腎功能檢測

給藥結(jié)束次日，小鼠眼眶采血，3000×g離心10 min得到血清，用全自動生化分析儀測定血清肌酐(creatinine，Crea)以及血清尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)水平。

1.4 腎系數(shù)的測定

小鼠手術(shù)分離取腎，除去周圍結(jié)締脂肪組織，用冷生理鹽水沖洗，除去血液，濾紙拭干，電子天平精確稱重，按下述公式計算腎系數(shù):

腎系數(shù)(mg·g－1)=腎質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)。

1.5 腎NO水平的檢測

取1 g腎組織加入9 ml生理鹽水于玻璃勻漿管中制成10% 組織勻漿，于4℃ 12 000×g離心20 min，取上清，按照試劑盒說明采用分光光度法進行NO指標檢測。

1.6 腎MDA水平、比色法檢測腎GSH-Px和SOD活性的測定

取制備好的腎組織勻漿上清液，按照說明書硫代巴比妥酸法檢測腎組織勻漿的MDA含量、以比色法檢測GSH-Px和SOD活性。

1.7 組織病理學(xué)觀察

腎用體積分數(shù)為10%甲醛固定48 h，經(jīng)常規(guī)取材，脫水后石蠟包埋，制片，HE染色，在光鏡下檢查。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 D-硝基精氨酸對小鼠血清肌酐和尿素氮水平的影響

表1結(jié)果顯示，與5%葡萄糖對照組比較，血清中BUN隨D-NNA劑量的增加而增加(P＜0.05);D-NNA 150 和 50 mg·kg－1組 Crea明顯升高(P ＜0.05)，D-NNA 15 mg·kg－1組無顯著變化。

2.2 D-硝基精氨酸對小鼠腎系數(shù)的影響

與5%葡萄糖對照組腎系數(shù)(17.74±0.69)mg·g－1相 比，D-NNA 150 mg·kg－1組 腎 系 數(shù)(16.74 ±0.55)mg·g－1明顯降低(P ＜0.05)，D-NNA 50和15 mg·kg－1組腎系數(shù)無明顯差異，分別為17.64 ±1.19和(17.49 ±1.17)mg·g－1。

表1D-硝基精氨酸(D-NNA)對小鼠血清尿素氮(Crea)和尿肌酐(BUN)水平的影響Tab.1 Effect of NG-nitro-D-arginine(D-NNA)on serum creatinine(Crea)and blood urea nitrogen(BUN)levels of mice

2.3 D-硝基精氨酸對小鼠腎組織中NO水平的影響

與5%葡萄糖對照組小鼠腎組織中NO水平(12.8 ± 1.2)μmol·L－1相比，只有 D-NNA 150 mg·kg－1小鼠腎組織中 NO 水平為(10.2 ± 2.6)μmol·L－1，明顯降低(P ＜ 0.05)，D-NNA 50 和 15 mg·kg－1組腎組織中NO水平無明顯差異，分別為(11.4 ±2.2)μmol·L－1和(12.2 ±1.6)μmol·L－1。

2.4 D-硝基精氨酸對小鼠腎MDA水平和GSH-Px及SOD活性的影響

如表2所示，與5%葡萄糖對照組相比，D-NNA 50和150 mg·kg－1組 MDA 水平和 SOD 和 GSH-Px活性明顯升高(P ＜0.01，P ＜0.05)，D-NNA 15 mg·kg－1組無顯著差異。

表2D-NNA對小鼠腎丙二醛(MDA)含量，谷胱甘肽過氧化酶(GSH-Px)及超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響Tab.2 Effect of D-NNA on the level of renal malondialdehyde(MDA)，superoxide dismutase(SOD)and glutathione peroxidase(GSH-Px)activities of kidneys of mice

2.5 D-硝基精氨酸對小鼠腎組織的作用

光鏡檢查發(fā)現(xiàn)，5%葡萄糖對照組小鼠腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)清晰、形態(tài)正常，無異常病理表現(xiàn)(圖1A)。D-NNA給藥組小鼠腎產(chǎn)生一定的病理形態(tài)變化，D-NNA 15和50 mg·kg－1主要表現(xiàn)為炎癥細胞浸潤(圖1B，C)。D-NNA 150 mg·kg－1組主要表現(xiàn)為腎小管損傷，嗜堿性變、萎縮或囊性擴張，間質(zhì)炎性浸潤(圖1D)。

圖1 D-硝基精氨酸對小鼠腎組織的作用.動物分組及給藥見表1.A:5%葡萄糖對照組，腎組織結(jié)構(gòu)正常;B:D-NNA 15 mg·kg－1組，間質(zhì)炎性浸潤(箭頭所示);C:D-NNA 50 mgp·kg－1組，間質(zhì)炎性浸潤(箭頭所示);D:D-NNA 150 mg·kg－1組，腎小管損傷，間質(zhì)炎性浸潤.Fig.1 Effect of D-NNA on kidney morphology of mice.

3 討論

Crea和BUN是腎功能的主要指標，如果腎功能受損，排除尿素的能力自然下降，血液中 Crea和BUN水平就會升高。本實驗對ICR小鼠給予D-NNA 150和 50 mg·kg－1后，小鼠血清中 Crea和BUN的含量明顯升高，表明D-NNA對腎功能具有損傷作用，腎病理學(xué)檢查同樣證實長期給予D-NNA會引起腎病理改變。

研究表明，腎是D-NNA在體內(nèi)發(fā)生手性轉(zhuǎn)化的主要器官，在手性轉(zhuǎn)化過程中產(chǎn)生了大量對腎有損傷的 ROS［8－9］，ROS 可以和細胞大分子反應(yīng)，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化。脂質(zhì)過氧化可能導(dǎo)致膜損傷，SOD和GSH-Px 是機 體 主要 的抗 氧 化 酶［10－12］，SOD 和GSH-Px水平反映機體抗氧化能力。MDA是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，通過MDA含量可以反映脂質(zhì)過氧化程度［13］。本實驗給予 ICR小鼠 D-NNA 150和50 mg·kg－1后，小鼠腎組織MDA水平明顯升高，SOD活性和GSH-Px活性明顯下降，表明D-NNA對腎具有一定的氧化損傷作用。

L-NNA是D-NNA發(fā)生手性轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物，L-NNA是一種 NOS抑制劑，在體內(nèi) NO是由 NOS催化L-NNA氧化生成，NO作為體內(nèi)的重要信號分子，它能舒張血管，抑制血小板黏附、聚集，抑制白細胞黏附、浸潤，減輕炎癥介導(dǎo)的細胞壞死，從而保護組織細胞。本實驗長期給予 ICR小鼠 D-NNA 150 mg·kg－1后發(fā)現(xiàn)，腎NO水平明顯降低，在生理條件下釋放的NO使血小板處于較低水平的活化狀態(tài)，防止其黏附聚集，NOS活性受到抑制使NO合成減少，導(dǎo)致血小板活化，并釋放血栓素、5-羥色胺、腺嘌呤核苷酸、血小板源性生長因子等引起血管收縮，平滑肌細胞增生并向內(nèi)膜下遷移，白細胞向內(nèi)膜黏附，破壞內(nèi)皮細胞功能［14］，當內(nèi)皮細胞功能破壞時，局部血管收縮，血小板黏附、聚集功能增強，血液黏滯性增高，加重微循環(huán)障礙，增加外周阻力，導(dǎo)致血壓升高［15］從而對腎造成損傷作用。

D-NNA的手性轉(zhuǎn)化產(chǎn)物L(fēng)-NNA能抑制NOS活性導(dǎo)致NO生成減少，手性轉(zhuǎn)化過程中產(chǎn)大量ROS，而哺乳動物對外源物進行生物轉(zhuǎn)化過程中產(chǎn)生的活性氧自由基能夠破壞機體的抗氧化防御系統(tǒng)［16］，使機體受到超氧游離基的攻擊造成組織細胞損傷［17－18］。腎是D-NNA發(fā)生手性轉(zhuǎn)化的主要器官，約有80%D-NNA在腎發(fā)生手性轉(zhuǎn)化，對腎造成的損傷較大，所以使小鼠腎質(zhì)量和腎系數(shù)變小。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，長期給予D-NNA對小鼠腎具有一定的損傷作用，且存在一定的劑量關(guān)系，其氧化應(yīng)激的機制與D-NNA的手性轉(zhuǎn)化產(chǎn)物L(fēng)-NNA導(dǎo)致NO合成減少，造成腎血管系統(tǒng)功能病變以及在轉(zhuǎn)化過程中產(chǎn)生的ROS有關(guān)。

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