雌激素預(yù)處理增強(qiáng)肝缺血再灌注損傷大鼠雌激素受體表達(dá)

胡禮宏，韓新生，郭建榮

(1.寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬李惠利醫(yī)院麻醉科，浙江寧波 315040;2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院麻醉科，陜西西安 710004)

研究顯示雌激素對(duì)心、腦等器官的缺血再灌注損傷(ischemia/reperfusion injury，I/R)均具有保護(hù)作用。其機(jī)制涉及雌激素抑制核因子κB(NF－κB)表達(dá)，促進(jìn)還原型氧化氮合酶表達(dá)，減輕細(xì)胞凋亡，抗自由基，抗氧化等等［1－2］。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，肝I/R后雌性動(dòng)物的存活率明顯要高于雄性動(dòng)物，并發(fā)現(xiàn)雌激素對(duì)肝I/R損傷具有保護(hù)作用，可能是通過(guò)降低血清腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor－α，TNF－α)水平，抑制肝組織NF－κB表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的［3－5］。研究發(fā)現(xiàn)，肝中存在雌激素受體(estrogen receptor，ER)，但是未見(jiàn)有關(guān)ER在肝I/R損傷中相關(guān)作用的報(bào)道。本研究擬用雄性大鼠肝I/R損傷模型觀察雌激素預(yù)處理后ER的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 試劑

17－β－雌二醇(17－beta－estrogen)，批號(hào):20080150，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;TNF－α試劑盒購(gòu)自上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司，NF－κB p65、ERα 試劑盒、DAB和SABC試劑盒購(gòu)自武漢博士德公司。

1.2 動(dòng)物及模型制備

1.3 動(dòng)物分組

90只大鼠隨機(jī)分成3組，每組30只。假手術(shù)組僅行麻醉、開(kāi)腹、分離肝門、關(guān)腹，術(shù)前1 h大鼠ip給予等量生理鹽水。I/R組，肝缺血前1 h大鼠ip給予等量生理鹽水;雌激素預(yù)處理+I/R組，在肝缺血前1 h大鼠ip給予雌二醇4 mg·kg－1。分別于肝缺血前(R0)、再灌注1 h(R1)，R3，R6和R24時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)本檢測(cè)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只大鼠。

1.4 血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)及TNF-α水平檢測(cè)和肝組織形態(tài)觀察

分別在各時(shí)間點(diǎn)沿著大鼠劍突剪開(kāi)胸腔，暴露心臟，右心室取4 ml血液，分裝于Eppendorf導(dǎo)管中，室溫下 1000×g離心 10 min分離出血清，－20℃保存待測(cè)。用全自動(dòng)生化檢測(cè)儀檢測(cè)血清ALT水平，ELISA法測(cè)定血清TNF－α水平。同時(shí)取肝左中葉組織，用冰生理鹽水沖洗后用10%甲醛溶液浸泡固定，制作石蠟切片，觀察肝組織形態(tài)學(xué)變化。

1.5 SABC法檢測(cè)肝組織NF-κB和ERα的表達(dá)

切片行多聚賴氨酸處理，采用SABC法檢測(cè)肝組織NF－κB和ERα的表達(dá)情況。400倍顯微鏡下，細(xì)胞膜、細(xì)胞核和(或)細(xì)胞漿呈棕色視為陽(yáng)性肝細(xì)胞。每張切片隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)視野，觀察陽(yáng)性肝細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性率(%)=陽(yáng)性肝細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 雌激素預(yù)處理對(duì)肝缺血再灌注損傷大鼠血清ALT及TNF-α水平的影響

表1及表2結(jié)果顯示，肝I/R后，血清ALT及TNF－α水平明顯升高。I/R后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，I/R和雌二醇+I/R組ALT及TNF－α水平明顯高于缺血前，隨著再灌注時(shí)間延長(zhǎng)逐漸上升，于再灌注6 h達(dá)到高峰，到再灌注24 h時(shí)已顯著下降。與假手術(shù)組相比，再灌注6 h時(shí)，I/R和雌二醇+I/R組ALT水平分別升高了11.7 倍和8.1 倍(P ＜0.01)，TNF－α 水平分別升高了5.2倍和3.2倍(P ＜0.01)。組間同時(shí)間點(diǎn)比較，雌二醇+I/R組明顯低于I/R組(P＜0.05)。假手術(shù)組缺血前后各時(shí)間點(diǎn)的血清ALT及TNF－α水平無(wú)明顯變化。

2.2 雌激素預(yù)處理對(duì)肝缺血再灌注損傷大鼠肝組織形態(tài)的影響

鏡下可見(jiàn)假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)肝組織變化無(wú)顯著性差異。缺血前，假手術(shù)組、I/R組和雌二醇+I/R組無(wú)明顯損傷。假手術(shù)組再灌6 h肝組織無(wú)改變(圖1A)，I/R組再灌注后，可見(jiàn)逐漸增多的肝細(xì)胞水腫和脂肪變性(圖1B);再灌注6 h時(shí)除可見(jiàn)增多的細(xì)胞水腫外，還可見(jiàn)點(diǎn)狀細(xì)胞壞死和嗜酸性變性;再灌注24 h時(shí)仍可見(jiàn)細(xì)胞水腫和脂肪變性(照片未提供)，但點(diǎn)狀細(xì)胞壞死和嗜酸性變性較再灌注6 h時(shí)有所減輕;雌二醇+I/R組再灌6 h變化趨勢(shì)同I/R組(圖1C)，但各時(shí)間點(diǎn)的損傷程度明顯輕于I/R組，未見(jiàn)點(diǎn)狀壞死(照片未提供)。

表1 雌激素預(yù)處理對(duì)大鼠肝缺血再灌注(I/R)損傷血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)水平的影響Tab.1 Effect of estrogen pretreatment on alanine aminotransferase(ALT)levels in rats with hepatic ischemia/reperfusion(I/R)injury

表2 雌激素預(yù)處理對(duì)肝I/R損傷大鼠血清腫瘤壞死因子(TNF-α)水平的影響Tab.2 Effect of estrogen pretreatment on TNF-α levels in rats with hepatic I/R injury

圖1 雌激素預(yù)處理對(duì)肝I/R損傷大鼠肝組織形態(tài)變化(HE×400).A:假手術(shù)組再灌注6 h;B:I/R組再灌注6 h肝組織;C:雌二醇+I/R組再灌注6 h肝組織.Fig.1 Effect of estrogen pretreatment on the change of tissue in rats with hepatic I/R injury(HE ×400).

2.3 雌激素預(yù)處理對(duì)肝缺血再灌注損傷大鼠肝組織NF-κB表達(dá)的影響

表3及圖2結(jié)果顯示，在各組肝組織中均可見(jiàn)NF－κB不同程度的表達(dá)。假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)NF－κB表達(dá)無(wú)顯著性差異。在I/R組和雌二醇+I/R組隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)NF－κB表達(dá)程度越高，再灌注6 h最高，到再灌注24 h時(shí)已顯著下降;與假手術(shù)組相比，再灌注6 h時(shí)I/R組和雌二醇+I/R組NF－κB表達(dá)分別升高了8.6倍和4.8倍(P＜0.01);再灌注后同時(shí)間點(diǎn)比較，I/R組NF－κB的表達(dá)明顯高于EI/R組(P＜0.05)，兩組的表達(dá)水平明顯高于假手術(shù)組(P ＜0.01)。

2.4 雌激素預(yù)處理后肝缺血再灌注損傷大鼠肝組織ERα表達(dá)的影響

顯微鏡下可見(jiàn)，各組肝細(xì)胞膜、細(xì)胞漿和細(xì)胞核均可見(jiàn)ERα不同程度的表達(dá)。假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)肝組織ERα表達(dá)水平無(wú)顯著性差異。I/R組和雌二醇+I/R組，隨再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)肝組織ERα表達(dá)程度明顯增強(qiáng)，至再灌注6 h時(shí)表達(dá)水平達(dá)高峰，至再灌注24 h時(shí)表達(dá)水平有所降低(P＜0.01);再灌注6 h時(shí)I/R組和雌二醇+I/R組ERα表達(dá)水平分別升高了4.2倍和7.4倍;但組間各時(shí)間點(diǎn)比較，雌二醇+I/R組的ERα表達(dá)水平明顯高于I/R組(P ＜0.05)(表4，圖3)。

表3 雌激素預(yù)處理對(duì)I/R大鼠肝組織NF-κB p65表達(dá)的影響Tab.3 Effect of estrogen pretreatment on NF-κB p65 levels in rats with hepatic I/R injury

圖2 雌激素預(yù)處理對(duì)肝I/R損傷大鼠肝組織NF-κB p65表達(dá)的影響(ABC×400).分組處理見(jiàn)表1.A:假手術(shù)組再灌注6 h;B:I/R組再灌注6 h;C:雌二醇+I/R組再灌注6 h.圖中棕色顆粒為NF－κB p65表達(dá).Fig.2 Effect of estrogen pretreatment on NF-κB p65 in rats with hepatic I/R injury(ABC ×400).

表4 雌激素預(yù)處理對(duì)肝I/R損傷大鼠肝組織雌激素受體α(ERα)表達(dá)的影響Tab.4 Effect of estrogen pretreatment on estrogen receptorα(ERα)levels in rats with hepatic I/R injury

圖3 雌激素預(yù)處理對(duì)肝I/R損傷大鼠肝組織雌激素受體α(ERα)表達(dá)的影響 (ABC×400).A:假手術(shù)組再灌注6 h肝組織ERα表達(dá);B:I/R組再灌注6 h肝組織ERα表達(dá);C:雌二醇+I/R組再灌注6 h.圖中棕色顆粒為ERα陽(yáng)性表達(dá).Fig.3 Effect of estrogen pretreatment on nuclear estrogen receptor α(ERα)levels in rats with hepatic I/R injury(ABC ×400).

3 討論

肝I/R損傷在臨床上比較常見(jiàn)，如肝腫瘤切除、肝移植、休克等等，是導(dǎo)致肝功能衰竭的重要原因，也是目前研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。研究認(rèn)為，肝I/R損傷的發(fā)生機(jī)制可能與肝無(wú)氧代謝，Ca2+超載，氧自由基損傷，線粒體受損，微循環(huán)功能障礙，各種細(xì)胞因子作用，Kupffer細(xì)胞和中性粒細(xì)胞活化、NF－κB的激活以及細(xì)胞凋亡等有關(guān)。

有研究報(bào)道，雌激素對(duì)腦、心等臟器I/R損傷具有保護(hù)作用［1－2］。Harada 等［3］研究發(fā)現(xiàn)，肝 I/R 損傷后雌鼠的存活率明顯高于雄鼠，而且用雌二醇治療的雄鼠肝細(xì)胞損害程度顯著輕于對(duì)照組，提示雌激素對(duì)肝I/R損傷有保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示，用雌激素預(yù)處理后，血清AST水平明顯下降，肝細(xì)胞損傷程度明顯減輕，這與已有的研究結(jié)論基本一致［4－5］。

ER是核受體超家族成員之一，主要位于胞漿和胞核內(nèi)，具有轉(zhuǎn)錄因子的作用［7－10］。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞膜上也存在ER，介導(dǎo)非基因組信號(hào)途徑［11－13］。ER主要分為ERα和ERβ兩種亞型，肝細(xì)胞上存在ER，分布于細(xì)胞膜、細(xì)胞漿和細(xì)胞核，且主要以α亞型為主［14－15］。雌激素與ER結(jié)合后通過(guò)基因組和非基因效應(yīng)發(fā)揮作用。故本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究α亞型來(lái)反映ER的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，肝細(xì)胞膜、細(xì)胞漿和細(xì)胞核上存在ER。肝I/R后肝組織ER表達(dá)升高，而雌激素預(yù)處理組ER的表達(dá)顯著高于I/R組，肝損傷程度也明顯減輕，說(shuō)明雌激素預(yù)處理后刺激ER的高表達(dá)，能夠減輕肝I/R損傷。

促炎癥細(xì)胞因子TNF－α在肝ER損傷過(guò)程中起到重要作用如觸發(fā)細(xì)胞凋亡，直接導(dǎo)致肝竇內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，導(dǎo)致肝微循環(huán)障礙;激活中性粒細(xì)胞釋放氧自由基;刺激單核巨噬細(xì)胞和其他細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素1(interleukin－1，IL－1)，IL－6 等炎性因子。在本研究中，I/R組血漿TNF－α水平明顯升高，而雌二醇+I/R組TNF－α活性明顯低于I/R組。由此說(shuō)明雌激素預(yù)處理后ER的高表達(dá)可以顯著降低肝I/R導(dǎo)致的TNF－α升高。

肝I/R可引起缺血缺氧、氧化應(yīng)激、Ca2+超載，中性粒細(xì)胞釋放多種蛋白酶以及活性氧，Kupffer細(xì)胞活化等多種途徑激活 NF－κB，NF－κB 激活后通過(guò)調(diào)節(jié)一系列基因的表達(dá)，如釋放前炎癥細(xì)胞因子TNF－α、IL－1、IL－6、細(xì)胞黏附分子－1、選擇素等直接或間接地參與肝I/R損傷［16－17］。本研究結(jié)果顯示，肝I/R后，肝組織NF－κB表達(dá)明顯升高，雌激素預(yù)處理組明顯低于I/R組，肝損傷也明顯減輕，ER表達(dá)增加，說(shuō)明ER的高表達(dá)與抑制NF－κB的表達(dá)和其下游的炎癥細(xì)胞因子有關(guān)，進(jìn)而減輕肝I/R損傷。

綜上所述，雌激素預(yù)處理能刺激并增強(qiáng)ER的表達(dá)，進(jìn)而減輕肝I/R損傷，其機(jī)制可能與抑制了NF－κB的表達(dá)和降低血清TNF－α水平有關(guān)。

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