蛛網(wǎng)膜下隙注射膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子抑制脊神經(jīng)結(jié)扎大鼠脊髓背角膠質(zhì)原纖維酸性蛋白表達(dá)

郭建榮，賈東林，金寶偉，廉姜芳，袁曉紅，沈華春

(1.寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬李惠利醫(yī)院麻醉科，浙江寧波 315040;2.北京大學(xué)第三醫(yī)院麻醉科，北京 100191;3.寧波市器官移植研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江寧波 315040)

神經(jīng)病理性疼痛是一種嚴(yán)重影響人類健康的疾病，甚至可導(dǎo)致患者最終失去行動能力，全世界患者達(dá)數(shù)百萬人，是神經(jīng)科學(xué)研究的一個(gè)重要課題。膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)是從大鼠膠質(zhì)細(xì)胞系B49的無血清培養(yǎng)液中分離純化得到的一種新型神經(jīng)營養(yǎng)因子。近來動物實(shí)驗(yàn)研究顯示，GDNF通過靶細(xì)胞的逆向軸突運(yùn)輸調(diào)節(jié)脊髓神經(jīng)細(xì)胞的代謝及功能，對神經(jīng)元C纖維的中樞軸突具有營養(yǎng)支持作用，抑制其退變，使之保持正常的突觸聯(lián)系。對損傷所繼發(fā)的細(xì)胞變性有促進(jìn)恢復(fù)效應(yīng)，與神經(jīng)病理性疼痛關(guān)系密切［1－4］。有關(guān)疼痛調(diào)控的中樞機(jī)制研究是當(dāng)今疼痛研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，但無論從電生理方面，還是從組織學(xué)、細(xì)胞或分子水平，目前大多均局限于神經(jīng)元的研究。近年來對星形膠質(zhì)細(xì)胞的研究表明［5－7］，其細(xì)胞膜上存在著許多離子通道和神經(jīng)遞質(zhì)的受體，能夠產(chǎn)生和釋放多種神經(jīng)活性物質(zhì)，在慢性疼痛的形成和發(fā)展中起著重要的作用。膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中星形膠質(zhì)細(xì)胞的特征性標(biāo)志物。前期研究結(jié)果表明，鞘內(nèi)注射GDNF可減輕大鼠神經(jīng)病理性疼痛［8－9］。但鞘內(nèi)注射 GDNF 能否抑制GFAP蛋白的表達(dá)尚待探討。本研究觀察脊神經(jīng)結(jié)扎(spinal nerve ligation，SNL)大鼠脊髓背角 GFAP蛋白表達(dá)的變化以及蛛網(wǎng)膜下隙給予GDNF對其影響，探討GDNF減輕大鼠神經(jīng)病理性疼痛的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和藥品

GDNF(英國Pepro Tech Inc公司)，抗GFAP多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，SABC免疫組化檢測試劑盒(武漢博士德公司)，羊抗大鼠GFAP多克隆抗體(Santa Cruz公司)。

1.2 動物、模型制備與分組

健康純種Sprague-Dawley(SD)大鼠，6周齡，雄性，體質(zhì)量180～200 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，動物合格證號:SCXK(京)2007-2008，飼養(yǎng)于鋪墊鋸末塑料盒內(nèi)，每籠5只飼養(yǎng)，自然照明，自由飲水?dāng)z食。大鼠神經(jīng)病理性疼痛模型的制備以及蛛網(wǎng)膜下腔置管按照文獻(xiàn)［10］進(jìn)行。大鼠ip給予1%戊巴比妥40 mg·kg－1麻醉后，置于俯臥位，背部切開皮膚，鈍性分離左側(cè)椎旁肌肉，暴露第5腰脊神經(jīng)(L5)，并用6號絲線緊緊結(jié)扎，然后在骶骨角處分離出第6腰脊神經(jīng)(L6)并結(jié)扎。止血、縫合并注射青霉素預(yù)防感染。假手術(shù)大鼠操作與手術(shù)大鼠相同，但只暴露脊神經(jīng)，并不結(jié)扎。手術(shù)操作均由同一組人完成，以保證一致性。SD雄性大鼠隨機(jī)分為4組，每組30只:正常對照組，假手術(shù)組，SNL模型組和GDNF 2 μg組。GDNF組脊神經(jīng)結(jié)扎后隔日一次性蛛網(wǎng)膜下隙注射 10 μl GDNF 2 g·L－1。每組分別于術(shù)后第3天，第7天和第14天，進(jìn)行行為學(xué)評估后處死大鼠，每組10只。取其脊髓組織用于免疫組織化學(xué)檢查和Western印跡測定。

1.3 免疫組化法檢測膠質(zhì)原纖維酸性蛋白表達(dá)

將所取各組腰膨大段常規(guī)制成石蠟塊，切片厚為5 μm。脊髓切片經(jīng)二甲苯脫蠟、乙醇梯度脫水、滅活內(nèi)源性過氧化氫酶、封閉，加入GFAP多克隆抗體，4℃過夜后，依次加入生物素標(biāo)記的二抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈酶卵白素，之后3，3'-聯(lián)苯二胺(DAB)顯色，乙醇脫水，二甲苯透明，封片后顯微鏡下照相。為確認(rèn)免疫組化染色的特異性，以PBS代替一抗溶液作為陰性對照，其余染色步驟(包括滴加二抗溶液)完全相同。陽性對照為已知GFAP蛋白染色陽性標(biāo)本切片。采用病理圖像分析儀，胞漿和(或)胞核有棕黃色顆粒為陽性信號，每例切片分別取3個(gè)高倍視野(×400)，選用同批染色切片在全自動醫(yī)學(xué)彩色圖像分析系統(tǒng)軟件下測定陽性信號。GFAP陽性細(xì)胞表達(dá)以灰度值來表示，采用圖像分析軟件對圖像進(jìn)行分析，陽性產(chǎn)物的面積占圖像框總面積的相對面積稱灰度值，在灰度閾值相同的條件下，灰度值與陽性細(xì)胞反應(yīng)為正比關(guān)系。每一切片測量3個(gè)視野，求其平均值。

1.4 Western印跡法測定膠質(zhì)原纖維酸性蛋白表達(dá)

將所取各組脊髓背角先放入預(yù)冷的勻漿液中，低溫勻漿，離心取上清。繪制標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線，以考馬斯亮藍(lán)法測定樣本蛋白濃度，加入1/3體積的4倍樣本緩沖液95℃變性5 min。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，硝酸纖維素膜電轉(zhuǎn)，用考馬斯亮藍(lán)對凝膠進(jìn)行染色。與兔抗GFAP蛋白一抗(1∶400)4℃孵育雜交過夜，加入二抗，室溫振蕩孵育1.5 h，用NBT/BCIP檢測反應(yīng)條帶，半定量分析。影像分析儀進(jìn)行圖像分析，以β肌動蛋白為內(nèi)標(biāo)，以各組的積分吸光度值(integrated absorance，IA)與β肌動蛋白的IA的比值表示GFAP蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 GDNF對GFAP表達(dá)的影響

2.1.1 免疫組化

免疫組化染色結(jié)果顯示，GFAP存在于星形膠質(zhì)細(xì)胞胞漿和突起中，其構(gòu)成脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞組織的一部分。GFAP陽性表達(dá)免疫產(chǎn)物為棕黃色顆粒，凡胞漿、細(xì)胞突起呈現(xiàn)棕黃色著色的膠質(zhì)細(xì)胞為陽性反應(yīng)。正常對照組和假手術(shù)組脊髓背角中可見少量淡染的棕黃色GFAP陽性細(xì)胞，零散分布，細(xì)胞排列整齊，胞體形態(tài)稍不規(guī)則，體積較小，有多個(gè)短至中等長度的突起。SNL組在術(shù)后第3天、第7天和第14天脊髓GFAP陽性細(xì)胞數(shù)目明顯增加，染色顯著加深，胞體增大，突起增粗，可持續(xù)至本實(shí)驗(yàn)觀察到的第14天，而正常對照組與假手術(shù)組的星形膠質(zhì)細(xì)胞未發(fā)生此種改變。GDNF組的陽性細(xì)胞顯著減少，染色較淺，突起短細(xì)(圖1，表1)。

圖1 膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)對脊神經(jīng)結(jié)扎(SNL)大鼠脊髓背角膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)表達(dá)影響的典型免疫組化表現(xiàn).采用結(jié)扎大鼠第5～第6腰脊神經(jīng)(L5～L6)制備SNL模型。GDNF組于模型制備成功后隔日一次性蛛網(wǎng)膜下隙注射10 μl GDNF 2 g·L－1.假手術(shù)組給予生理鹽水10 μl.分別于第3天、第5天和第7天麻醉大鼠，取L5～L6脊髓制備樣品.A:正常對照組;B:假手術(shù)組;C:SNL模型組;D:模型+GDNF組.SNL組有大量激活的星型膠質(zhì)細(xì)胞(箭頭示);GFAP陽性細(xì)胞輪廓清晰，星狀突起纖細(xì)(箭頭示)，GFAP分布于胞漿及星狀突(箭頭示).Fig.1 Effect of glial cell line-derived neurotrophic factor(GDNF)on glial fibrillary acidic protein(GFAP)expression at spinal dorsal horn of spinal nerve ligation(SNL)rats by immunohistochemistry assay.

表1 GDNF對SNL大鼠脊髓背角GFAP表達(dá)的影響Tab.1 Effect of GDNF on GFAP expression in SNL rats

2.1.2 Western 印跡

Western印跡檢測結(jié)果顯示，正常對照組和假手術(shù)組脊髓背角均出現(xiàn)GFAP免疫陽性條帶，灰度值較低;SNL可誘導(dǎo)脊髓背角GFAP蛋白的表達(dá)，隨著時(shí)間的延長，GFAP蛋白的灰度值逐漸升高;與SNL組比較，GDNF可顯著降低GFAP的表達(dá)水平(P＜0.01)(圖2，表2)。

圖2 Western印跡法測定GDNF對SNL大鼠脊髓背角GFAP表達(dá)的影響.動物分組給藥見圖1.A，B，C分別為第3天，第7天，第14天;條帶1～4分別為正常對照組，假手術(shù)組和SNL模型組和模型+GDNF組.Fig.2 Effect of GDNF on GFAP expression in the spinal dorsal horn of SNL rats by Western blotting.

表2 GDNF對SNL大鼠脊髓背角GFAP表達(dá)的影響Tab.2 Effect of GDNF on GFAP expression in the spinal dorsal horn of SNL rats by Western blotting

3 討論

近來研究證實(shí)，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞參與慢性病理性疼痛的發(fā)生和維持。在各種不同的病理性疼痛動物模型中，如在甲醛炎性疼痛模型和脊神經(jīng)結(jié)扎神經(jīng)病理性疼痛模型中均發(fā)現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞被激活［11－12］。用藥物抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的激活能阻止病理性疼痛的發(fā)展［13］。疼痛過程中所累及的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞主要是小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞［14］。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的激活是產(chǎn)生疼痛擴(kuò)大狀態(tài)的必要條件［15］。膠質(zhì)細(xì)胞主導(dǎo)的神經(jīng)炎癥和神經(jīng)免疫反應(yīng)在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生、維持中發(fā)揮重要作用。

GFAP是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中星形膠質(zhì)細(xì)胞的特征性標(biāo)志物。當(dāng)機(jī)體受到某種刺激時(shí)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)某些部位的星形膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)GFAP的陽性表達(dá)，表明星形膠質(zhì)細(xì)胞對此刺激產(chǎn)生反應(yīng)，反映出星形膠質(zhì)細(xì)胞在此時(shí)的活性增強(qiáng)。在病理性神經(jīng)疼痛發(fā)生過程中，星形膠質(zhì)細(xì)胞被激活，GFAP大量增多，小膠質(zhì)細(xì)胞也被激活，說明痛覺過敏的產(chǎn)生和疼痛持續(xù)狀態(tài)有密切關(guān)系［7］。提示脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞被激活可能參與了外周神經(jīng)結(jié)扎所致疼痛的病理過程［16］。星形膠質(zhì)細(xì)胞一旦激活，可釋放多種神經(jīng)活性物質(zhì)，包括白細(xì)胞介素1(interleukin-1，IL-1)，IL-6，興奮性氨基酸，腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)，一氧化氮，前列腺素，活性氧，ATP和神經(jīng)生長因子等［14］。這些物質(zhì)通過提高初級傳入神經(jīng)P物質(zhì)、興奮性氨基酸的釋放量和增加產(chǎn)生疼痛物質(zhì)神經(jīng)元的興奮性來調(diào)節(jié)疼痛。激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放的IL-1，IL-6和TNF-α在星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元上都有其相應(yīng)的受體，直接作用于神經(jīng)元表面受體，或作用于其他免疫細(xì)胞，調(diào)節(jié)炎性因子的合成和釋放［17］，這些物質(zhì)具有自分泌和旁分泌功能，形成正反饋回路，不斷加重痛覺過敏。另外，活化的膠質(zhì)細(xì)胞還可影響神經(jīng)元的可塑性［18］。

脊髓是傳遞從外周到大腦疼痛信息的中轉(zhuǎn)站，傳遞疼痛的初級傳入神經(jīng)元軸突末梢終止于脊髓背角，在此與不同類型的脊髓次級神經(jīng)元進(jìn)行聯(lián)系。其中有髓鞘Aδ纖維和無髓鞘C纖維終止于脊髓背角淺層［19］，這兩種纖維均介導(dǎo)傷害性信息的傳遞。因此，脊髓背角淺層是和疼痛傳導(dǎo)相關(guān)的重要部位。

本研究結(jié)果表明，對照組和假手術(shù)組大鼠脊髓背角神經(jīng)細(xì)胞胞質(zhì)和胞核僅有少量GFAP蛋白表達(dá)，SNL組大鼠L5～L6脊髓背角GFAP蛋白表達(dá)水平明顯升高，比假手術(shù)組大鼠脊髓背角細(xì)胞胞質(zhì)和胞核GFAP蛋白表達(dá)增多，術(shù)后第3天明顯增加，第14天達(dá)到高峰，與其痛覺超敏時(shí)間相一致［8］。而與SNL組相比，GDNF組大鼠脊髓中GFAP蛋白表達(dá)顯著降低，提示SNL后脊髓背角GFAP蛋白表達(dá)的增加與SNL后的神經(jīng)病理性改變有關(guān)，說明調(diào)節(jié)機(jī)體神經(jīng)病理性疼痛的信息接收、整合、傳遞與大腦皮質(zhì)中神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞功能有關(guān)，即星形膠質(zhì)細(xì)胞參與SNL后的神經(jīng)病理性疼痛的形成和發(fā)展。而鞘內(nèi)給予GDNF可顯著降低GFAP蛋白的表達(dá)，提示GDNF的鎮(zhèn)痛作用機(jī)制與抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化有關(guān)。

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