貝那普利對(duì)糖尿病大鼠心肌細(xì)胞外基質(zhì)重塑中基質(zhì)金屬蛋白酶及轉(zhuǎn)化生長因子表達(dá)的影響

符麗娟，王洪新，包翠芬，隋海娟

(遼寧醫(yī)學(xué)院1.藥理學(xué)教研室，2.科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，遼寧錦州 121001)

糖尿病心肌細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)重塑主要表現(xiàn)為心肌纖維化、細(xì)胞外基質(zhì)中膠原沉積和細(xì)胞外基質(zhì)膠原構(gòu)型的改變。這種變化使活動(dòng)于其中的心肌細(xì)胞代謝和功能紊亂，導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大、凋亡、變性和壞死［1］。細(xì)胞外基質(zhì)重塑是導(dǎo)致糖尿病患者心室重構(gòu)及心臟功能異常的主要病理基礎(chǔ)?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一組能特異性地降解ECM成分的Zn2+依賴的酶家族，目前發(fā)現(xiàn)作用于心肌胞外基質(zhì)的MMPs主要有MMP-2、MMP-9和膜型1-MMP。金屬蛋白酶類組織抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs)是MMPs的特異性抑制因子，二者為ECM降解調(diào)節(jié)過程中一對(duì)重要的拮抗物，患糖尿病時(shí)各種病理因子可促進(jìn)膠原合成分泌，打破MMPs和TIMPs間的平衡，改變膠原蛋白分子的結(jié)構(gòu)，對(duì)糖尿病心肌細(xì)胞外基質(zhì)重塑起重要作用［2］。轉(zhuǎn)化生長因子 β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是促進(jìn)心肌間質(zhì)纖維化形成與發(fā)展的關(guān)鍵因子，與多臟器間質(zhì)纖維化有關(guān);結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)則是纖維化過程中的下游效應(yīng)因子，可促進(jìn)纖維細(xì)胞的增生和ECM 的聚積［3］。貝那普利(benazepril，BZ)為血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI)，其可通過抑制糖尿病心肌細(xì)胞凋亡，改善心室重構(gòu)，保護(hù)心臟功能［4］。本研究建立糖尿病大鼠心肌病模型，觀察BZ對(duì)糖尿病大鼠心肌 MMP-2，TIMP-2 及 TGF-β1，CTGF 表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討B(tài)Z對(duì)糖尿病心肌細(xì)胞外基質(zhì)重塑的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑及儀器

鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)，貨號(hào):H1027S，(Sigma公司)和BZ(美國Sigma公司)。多克隆兔抗鼠抗膠原Ⅰ型抗體(編號(hào):bs-0578R)、抗膠原Ⅲ型抗體(編號(hào):bs-0549R)、MMP-2抗體(編號(hào):bs-0412R)、TIMP-2 抗體(編號(hào):bs-0416R)、TGF-β1抗體(編號(hào):bs-0103R)和 CTGF抗體(編號(hào):bs-0743R)均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體和β肌動(dòng)蛋白和NBT/BCIP顯色液購自碧云天試劑公司。DY-1型電泳儀，上海醫(yī)療儀器公司;Mini-REPOTEANⅡ型電泳槽，美國 Bio-Rad公司;DYY-Ⅲ型電轉(zhuǎn)移槽，北京六一儀器廠;TGL-16G高速冷凍離心機(jī)，日本日立公司，JEOL-1200EX透射電鏡，日本電子公司。

1.2 動(dòng)物、模型制備及分組

SD大鼠，24只，♂，體質(zhì)量200～250 g，2月齡，由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(遼)2003-0007。16只大鼠一次性左下ip給予 1% STZ 溶 液 60 mg·kg－1［5］，臨 用 前 用 0.5 mmol·L－1的枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液(pH 4.5)配制。另8只大鼠為正常對(duì)照組，注射等量容積枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液 0.5 mmol·L－1(pH 4.5)。當(dāng)天即讓大鼠自由進(jìn)食飲水。注射后72 h測(cè)血糖及尿糖，將血糖濃度 ＞16.7 mmol·L－1，尿糖陽性者定為糖尿病模型(diabetic model，DM)大鼠。然后將糖尿病大鼠隨機(jī)分為DM和BZ組，BZ組ig給予BZ 10 mg·kg－1［6］，共 12 周。

1.3 心臟質(zhì)量指數(shù)檢測(cè)及心室標(biāo)本采集

開胸取出大鼠心臟，分別稱取心臟質(zhì)量(heart mass，HM)及左心室質(zhì)量(left ventricular mass，LVM)，計(jì)算心臟質(zhì)量指數(shù)(HM index，HMI)及左心室質(zhì)量指數(shù)(LVMI)。HMI(mg·g－1)=HM/BM，LVMI=LVH/BM。然后將左心室心肌一半置于4%多聚甲醛(pH 7.4)中固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，制作切片;一半置于－70℃冰箱，用于Western印跡檢測(cè)。

1.4 心肌組織病理檢查

1.4.1 光鏡觀察

取各組大鼠左心室心肌組織塊，4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋，制備心肌石蠟切片，HE染色，中性樹膠封片，鏡下觀察。

1.4.2 電鏡觀察

每組隨機(jī)取2只大鼠，ip注射20%烏拉坦麻醉，取左室心肌組織塊，切成1 mm3大小組織塊，超微標(biāo)本入3%戊二醛固定液固定2 h，1%鋨酸固定1 h，逐級(jí)乙醇、丙酮脫水后，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，經(jīng)鈾、鉛雙重染色后，透射電鏡觀測(cè)各組大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)變化。

1.5 Western印跡法檢測(cè)左心室心肌膠原Ⅰ型及Ⅲ型，MMP-2，TIMP-2，TGF-β1和 CTGF 蛋白表達(dá)

取約100 mg左心室心肌，立即放入預(yù)冷的Tris緩沖液中〔TBS，mmol·L－1:1%Triton，0.1%SDS，0.5%去氧膽酸，EDTA 1，Tris 20(pH 7.4)，NaCl 150，NaF 10〕，4℃超聲粉碎后，12 000×g離心30 min，取上清，用Lowry等［7］法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，以牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)為標(biāo)準(zhǔn)品，將各組蛋白濃度調(diào)成一致。用10%～12%SDSPAGE分離蛋白質(zhì)，每個(gè)泳道蛋白上樣量為20～50 μg。為了準(zhǔn)確判斷目的蛋白帶的位置，一個(gè)泳道加Seeblue plus 2預(yù)染蛋白標(biāo)記物。電泳后將PAGE凝膠中的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上，取出后將膜放入3%BSA阻斷緩沖液中，封閉60 min，再用TBS〔Tris 10 mmol·L－1(pH 8.0)，NaCl 150 mmol·L－1〕洗膜3次，每次10 min。將膜放入一抗中(所有一抗均1∶500稀釋)，4℃過夜。TBS沖洗后，將膜放入堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗中(二抗均1∶500稀釋)，室溫孵育1～2 h，然后用TBS洗膜3次，每次10 min，NBT/BCIP顯色液中避光顯色，直至出現(xiàn)，終止反應(yīng)。對(duì)膠原Ⅰ型及Ⅲ型，MMP-2，TIMP-2，TGF-β1和CTGF進(jìn)行測(cè)定。每個(gè)抗體測(cè)定時(shí)都進(jìn)行β肌動(dòng)蛋白測(cè)定，以保證蛋白上樣量的一致性。將蛋白印跡顯影圖掃描，利用凝膠自動(dòng)分析成像軟件Chem Image 5500對(duì)蛋白帶進(jìn)行積分吸光度值(integrated absorbance，IA)分析，以β肌動(dòng)蛋白為參照，計(jì)算二者IA比值表示膠原Ⅰ型及Ⅲ型，MMP-2，TIMP-2，TGF-β1和 CTGF 等的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 貝那普利對(duì)糖尿病大鼠心臟質(zhì)量指數(shù)和左心室質(zhì)量指數(shù)的影響

表1結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，DM組大鼠HMI和LVMI明顯增高，BZ組大鼠HMI和LVMI均明顯低于DM組(P＜0.01)。表明糖尿病大鼠已出現(xiàn)心肌肥厚，主要表現(xiàn)為左心室心肌肥厚，BZ可減輕糖尿病所致心肌肥厚。

2.2 貝那普利對(duì)糖尿病大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)的影響

HE染色顯示，正常對(duì)照組(圖1A)左室心肌細(xì)胞排列有序，DM組大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，可見肌纖維斷裂，心肌細(xì)胞肥大腫脹，心肌間質(zhì)及小血管周圍纖維增多(圖1B);BZ組病變減輕(圖1C)。

表1 貝那普利(BZ)對(duì)糖尿病模型(DM)大鼠心臟質(zhì)量指數(shù)(HMI)和左心室質(zhì)量指數(shù)(LVMI)的影響Tab.1 Effect of benazepril(BZ)on heart mass index(HMI)and left ventricular mass index(LVMI)of diabetic rats

圖2透射電鏡顯示，DM組大鼠心肌肌絲成分減少，局部斷裂，線粒體變性腫脹甚至空泡樣改變;心肌間質(zhì)纖維增多(圖2B)，毛細(xì)血管基底膜增厚。提示心肌超微結(jié)構(gòu)明顯損傷，心肌間質(zhì)纖維增生。而BZ組大鼠肌原纖維及線粒體結(jié)構(gòu)異常均有改善，間質(zhì)膠原減少，基底膜增厚明顯減輕。提示BZ可減輕心肌損傷，改善間質(zhì)纖維化(圖2C)。

圖2 貝那普利對(duì)DM大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)的影響(×10 000).分組處理見表1.A:正常對(duì)照組;B:DM模型組;C:BZ組.Fig.2 Effect of benazepril on cardiomyocyte ultrastructure of DM rats.

2.3 貝那普利對(duì)糖尿病大鼠心肌膠原Ⅰ型及Ⅲ型表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組比較，DM組大鼠心肌膠原Ⅰ型(1.09 ± 0.30 vs 0.35 ± 0.19)、膠 原 Ⅲ 型(1.73 ±0.25 vs 0.57 ±0.22)表達(dá)增加(P ＜0.05)。應(yīng)用 BZ后，大鼠心肌膠原Ⅰ型(0.49±0.20)、膠原Ⅲ型(0.67 ±0.32)表達(dá)明顯減少(P ＜0.05，P ＜0.01)(圖3)。

2.4 貝那普利對(duì)糖尿病大鼠心肌 MMP-2和TIMP-2表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組比較，DM組大鼠心肌TIMP-2表達(dá)增加，MMP-2表達(dá)減少(P＜0.01)，BZ組大鼠TIMP-2表達(dá)減弱，MMP-2表達(dá)增強(qiáng)(P＜0.05)(圖4)。

2.5 貝那普利對(duì)糖尿病大鼠心肌 TGF-β1和CTGF表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組比較，DM組大鼠心肌TGF-β1及CTGF表達(dá)增加(P ＜0.05，P ＜0.01)，BZ組大鼠心肌TGF-β1和 CTGF 表達(dá)減少(P ＜0.05)(圖5)。

圖3 Western蛋白印跡法檢測(cè)貝那普利對(duì)糖尿病大鼠心肌的膠原Ⅰ型及Ⅲ型表達(dá)的影響(A)及定量分析結(jié)果(B).條帶1:正常對(duì)照組;條帶2:DM模型組;條帶3:BZ組.IA:積分吸光度值.±s，n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01，與正常對(duì)照組比較;#P ＜0.05，##P ＜0.01，與 DM模型組比較.Fig.3 Effect of benazepril on cardiomyocyte collagen typeⅠcollagen and typeⅢexpression in diabetic rats by Western blotting(A)and semiquantitative results(B).

圖4 Western印跡法檢測(cè)貝那普利對(duì)糖尿病大鼠心肌的基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)和金屬蛋白酶組織抑制因子2(TIMP-2)表達(dá)的影響(A)及定量分析結(jié)果(B).條帶1:正常對(duì)照組;條帶2:DM模型組;條帶3:貝那普利組.±s，n=3.＊＊P ＜0.01，與正常對(duì)照組比較;#P ＜0.05，與 DM 模型組比較.Fig.4 Effect of benazepril on cardiomyocyte matrix metalloproteinases-2(MMP-2)，tissue inhibitor matrix metalloproteinases-2(TIMP-2)expression in diabetic rats by Western blotting(A)and semiquantitative results(B).

圖5 Western蛋白印跡法檢測(cè)貝那普利對(duì)糖尿病大鼠心肌組織的轉(zhuǎn)化生長因子 β1(TGF-β1)，結(jié)締組織生長因子(CTGF)蛋白表達(dá)的影響(A)及定量分析結(jié)果(B).條帶1:正常對(duì)照組;條帶2:DM模型組;條帶3:BZ組.±s，n=3.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01，與正常對(duì)照組比較;#P ＜0.05，與DM 模型組比較.Fig.5 Effect of benazepril on cardiomyocyte transforming growth factor-β1(TGF-β1)，connective tissue growth factor(CTGF)expression in diabetic rats by Western blotting(A)and semiquantitative results(B).

3 討論

正常心臟細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分為膠原，由心肌間隙中成纖維細(xì)胞產(chǎn)生和分泌的膠原纖維組成，分布于心臟細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原主要為膠原Ⅰ型及Ⅲ型。Searls等［8］研究表明，糖尿病時(shí)心肌成纖維細(xì)胞過度增生，可導(dǎo)致膠原合成增多，表現(xiàn)為膠原Ⅰ型及Ⅲ型增多，比例升高。本實(shí)驗(yàn)中糖尿病病程12周時(shí)，糖尿病大鼠心肌膠原Ⅰ型及Ⅲ型表達(dá)明顯增多，HMI和LVMI較正常對(duì)照組明顯增高，病理結(jié)果顯示心肌間質(zhì)纖維增生;表明此時(shí)糖尿病大鼠已存在心肌間質(zhì)纖維化及細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)。

Van Linthout等［9］證實(shí)，在 STZ 誘導(dǎo)的糖尿病倉鼠中可觀察到MMP-2 mRNA的表達(dá)、其前體以及活化的MMP-2的含量均有減少，同時(shí)伴TIMP-2含量增多。本研究顯示，糖尿病大鼠12周時(shí)心肌MMP-2表達(dá)減少，同時(shí)TIMP-2表達(dá)增加。表明糖尿病病程12周時(shí)MMP-2的活性減弱，TIMPs的生物活性相對(duì)增強(qiáng);并且左心室心肌膠原Ⅰ型及Ⅲ型含量明顯增加。提示MMPs與TIMPs二者平衡的失調(diào)可使細(xì)胞外基質(zhì)膠原合成和降解的平衡偏移，結(jié)果導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)膠原含量的增多。

有研究顯示糖尿病過程中心肌組織內(nèi)TGF-β1含量增多［10］。增多的 TGF-β1在ECM 和毛細(xì)血管基底膜處與間質(zhì)蛋白相結(jié)合，通過其Ⅰ型受體介導(dǎo)心臟成纖維細(xì)胞內(nèi)DNA合成，增加各種ECM成分，包括膠原Ⅰ型及Ⅲ型等。此外，有研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1可增加纖溶酶原激活物抑制劑PAI-1的分泌，抑制纖溶酶原激活而影響MMP活性，導(dǎo)致ECM降解減少［11－12］。本研究中病程12周時(shí)，糖尿病大鼠左心室心肌TGF-β1明顯增多，提示TGF-β1在心肌組織中過表達(dá)是導(dǎo)致糖尿病大鼠心肌膠原含量增多的原因之一。TGF-β1可通過CTGF依賴性途徑誘導(dǎo)膠原合成，刺激ECM合成，而CTGF則維持纖維化的發(fā)展［13］，具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。Way等［14］研究發(fā)現(xiàn)，STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠心肌中，CTGF mRNA的表達(dá)量是正常對(duì)照組動(dòng)物的2.4倍。Cheng等［15］研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠心肌細(xì)胞CTGF基因及蛋白表達(dá)亦增加，并參與了心肌纖維化進(jìn)程。本研究顯示，糖尿病大鼠左心室心肌CTGF與TGF-β1表達(dá)均明顯增加，表明糖尿病心肌損害與CTGF過度表達(dá)有關(guān)，CTGF與TGF-β1參與了糖尿病心肌纖維化的發(fā)生。且 TGF-β1及 CTGF的上調(diào)，可影響MMP2，TIMP-2表達(dá)，促使細(xì)胞外基質(zhì)膠原降解受抑制，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)中膠原沉積相對(duì)增多。

腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)的過度激活，血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)的異常作用與糖尿病心肌病密切相關(guān)［16－18］。本課題前期研究結(jié)果顯示，12周時(shí)糖尿病大鼠心肌AngⅡ明顯升高［4］;本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠心肌 TGF-β1和 CTGF表達(dá)也隨之增強(qiáng)，而MMP-2表達(dá)減少，TIMP-2表達(dá)增多，導(dǎo)致膠原Ⅰ型及Ⅲ型表達(dá)增加。應(yīng)用BZ后，大鼠心肌組織TGF-β1和CTGF表達(dá)均明顯降低，MMP-2表達(dá)增多，TIMP-2減少，且心肌中膠原I型及Ⅲ型含量降低。提示AngⅡ可通過刺激TGF-β1，CTGF的表達(dá)參與糖尿病心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展。BZ通過減少AngⅡ形成［4］，下調(diào) TGF-β1及 CTGF 表達(dá)，增加 MMP-2 表達(dá)，從而減少心肌膠原含量，減輕心肌間質(zhì)纖維化，改善糖尿病心肌細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)。

綜上所述，糖尿病心肌細(xì)胞外基質(zhì)重塑與TGF-β1及CTGF過度表達(dá)有關(guān)，BZ通過減少AngⅡ的形成，抑制TGF-β1及CTGF表達(dá)減少，進(jìn)而影響MMP-2和TIMP-2活性，抑制糖尿病心肌細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)。

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