Myostatin重組蛋白疫苗對(duì)小鼠骨骼肌質(zhì)量和力量的影響

唐量 張萬(wàn)金 王園麗 張英起

1 陜西師范大學(xué)體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室（西安 710062） 2 第四軍醫(yī)大學(xué)生物技術(shù)中心

運(yùn)動(dòng)和藥物治療多年來(lái)一直是臨床預(yù)防和治療肌萎縮的重要方法。除研究不同運(yùn)動(dòng)如耐力訓(xùn)練、抗阻力訓(xùn)練或被動(dòng)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練等治療肌肉萎縮的方法及機(jī)制外，尋找新的藥物靶分子也十分必要。最近的實(shí)驗(yàn)證明，肌肉萎縮與Myostatin異常表達(dá)升高密切相關(guān)。Lalani等［1］對(duì)雄性成年大鼠進(jìn)行17d模擬失重后證實(shí)，股二頭肌、股四頭肌、腓腸肌Myostatin mRNA和蛋白水平顯著高于對(duì)照組。Michelle等［2］對(duì)Wistar大鼠進(jìn)行10d后肢懸吊，發(fā)現(xiàn)Myostatin mRNA升高110%，蛋白水平上升37%。人體實(shí)驗(yàn)證明，成年男性臥床25d，伴隨著瘦體重、肌肉量下降，血液Myostatin濃度高于基礎(chǔ)值12%［3］。以上研究說(shuō)明模擬失重、后肢懸吊或臥床等誘發(fā)的廢用性肌肉萎縮可引起肌肉組織Myostatin表達(dá)異常升高，但針對(duì)Myostatin靶分子治療廢用性肌肉萎縮方面的研究報(bào)道仍少見。

Myostatin是骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育的主要負(fù)調(diào)控因子，屬于TGF-β超家族新成員，因其基因敲除后出現(xiàn)“雙肌”癥狀［4］而倍受關(guān)注。目前眾多研究報(bào)道了抗阻力運(yùn)動(dòng)［5，6］和游泳訓(xùn)練［7］等對(duì)Myostatin基因和蛋白表達(dá)的影響，證明抗阻力訓(xùn)練和耐力訓(xùn)練使肌肉肥大與Myostatin關(guān)系密切。本課題組近年來(lái)報(bào)道了Myostatin對(duì)骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控的研究進(jìn)展［8］和Myostatin基因多態(tài)性在杰出運(yùn)動(dòng)員選材中的應(yīng)用展望［9］，但有關(guān)蛋白水平上Myostatin活性抑制對(duì)骨骼肌質(zhì)量和力量影響的報(bào)道還少見。要準(zhǔn)確了解運(yùn)動(dòng)或Myostatin抑制劑干預(yù)Myostatin活性在肌肉形成中的作用機(jī)制，蛋白水平上的研究尤為重要。我們前期已利用基因工程技術(shù)構(gòu)建、表達(dá)和純化了高純度、無(wú)活性的Myostatin重組蛋白［10］，本實(shí)驗(yàn)以Myostatin重組蛋白作為疫苗免疫小鼠，觀測(cè)小鼠體重、肌細(xì)胞形態(tài)、骨骼肌質(zhì)量和力量等指標(biāo)的變化，探討Myostatin蛋白疫苗調(diào)控骨骼肌質(zhì)量和力量的效果及分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 對(duì)象與分組

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為雄性BALB/c小鼠，體重12～14g，共20只，購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。20只小鼠分成正常對(duì)照組和His-Ms免疫組2組，每組10只。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境保持高度清潔，自然光照，自由飲水和進(jìn)食，動(dòng)物室溫23～28℃，相對(duì)濕度50%～65%。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后His-Ms組小鼠進(jìn)行免疫實(shí)驗(yàn)。

1.2 免疫方案和體重

免疫蛋白His-Ms為基因工程技術(shù)構(gòu)建、表達(dá)和純化的高純度、無(wú)活性的Myostatin重組蛋白［10］。His-Ms 組小鼠按100 μg/只劑量進(jìn)行腹腔注射，每?jī)芍苊庖?次，共免疫4次［11］。正常對(duì)照組動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行免疫時(shí)腹腔注射相等體積的生理鹽水。實(shí)驗(yàn)期間，每周一、四早上10:00稱體重，取兩次稱重的平均值為每周體重。

1.3 取材

實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行62 d，最后一次免疫20 d后對(duì)照組和His-Ms組小鼠同時(shí)取材，眼眶采集血樣，然后迅速取出腹腔內(nèi)的游離脂肪組織稱重，再分離股四頭肌、腓腸肌和胸大肌，剝離附著在肌肉組織的包膜等非肌纖維組織，稱重并記錄。

1.4 骨骼肌形態(tài)分析

分離肌肉組織，在4℃固定液（10%中性福爾馬林，50 mmol/L PBS，pH7.2）中固定24 h，后在肌中間最隆起部位切片，置于4℃溶液（5%蔗糖，50 mmol/L PBS，pH7.2）中過(guò)夜，預(yù)冷的50%丙酮脫水，純丙酮脫水2次，二甲苯透明，浸蠟，石蠟（54℃～56℃）包埋，切片，HE（hematoxylin and eosin）染色，生物顯微鏡（Olympus IX70， 日本Olympus公司）觀察。為分析小鼠肌肉組織重量增加與肌細(xì)胞肥大（hypertrophy）或肌細(xì)胞增生（hyperplasia）之間的關(guān)聯(lián)，實(shí)驗(yàn)利用Scion Image4.02軟 件（http：//www.scioncorp.com）， 從對(duì)每組隨意選6只小鼠共1000個(gè)股四頭肌細(xì)胞的橫斷面積和每束肌纖維的平均細(xì)胞數(shù)，按Lee等［12］報(bào)道的方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 血清常規(guī)指標(biāo)測(cè)定

采用全自動(dòng)生化分析儀（日本日立公司）檢測(cè)血清膽固醇（CHO）、甘油三脂（TG）、尿素氮（BUN）、血糖（GLU）、肌酸激酶（CK）等血液指標(biāo)。試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.6 抓力測(cè)試

小鼠處死前1d對(duì)其前肢抓力進(jìn)行測(cè)試。參考并改進(jìn)Peled-Kamar等［13］報(bào)道的前肢抓力測(cè)試方法，在離地高80 cm處綁緊一根直徑2 mm的繩子，讓小鼠前肢握住繩子，并固定尾部，記錄小鼠掉落前持續(xù)握住繩子的時(shí)間，即完成一次抓力測(cè)試。重復(fù)3次取平均值。抓力測(cè)試重復(fù)間隔時(shí)間盡可能一致。

1.7 細(xì)胞ELISA測(cè)定小鼠蛋白疫苗血清抗體滴度

利用PVAC-Ms轉(zhuǎn)染并鑒定可表達(dá)Myostatin蛋白的CHO細(xì)胞［14］，轉(zhuǎn)染36h后，吸去培養(yǎng)液，37℃干燥后用0.025%戊二醛（PBS配制，pH7.4）室溫固定20 min，PBS洗孔3遍。每孔加入200 μl含3% H2O2PBS，室溫反應(yīng)20 min，PBS洗孔3遍。在細(xì)胞包被孔中分別加入兩組各6只小鼠不同稀釋度的待測(cè)血清，每孔200 μl，設(shè)復(fù)孔，陰性對(duì)照，37℃溫箱反應(yīng)l h，用洗液洗3遍。加入1:10000生物素化的羊抗小鼠IgG抗體，每孔200 μl，37℃反應(yīng)l h，洗孔3遍，甩干。加入1:200親和素化辣根過(guò)氧化物酶，每孔200 μl，37℃反應(yīng)30 min，洗孔3遍。加OPD-H2O2底物200 μl，37℃避光反應(yīng)，加2M H2SO4終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）測(cè)各孔OD450nm值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用Excel 2000對(duì)所測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，進(jìn)行兩組間非成對(duì)均值t檢驗(yàn)，P < 0.05表示有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 小鼠體重變化和組織重量比較

由圖1可見，第6周開始至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，His-Ms組免疫小鼠體重增加幅度略大于正常對(duì)照組。表1顯示， His-Ms組小鼠最后一周體重與正常對(duì)照組比較平均增加3.6%，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與正常對(duì)照組比較，His-Ms組小鼠股四頭肌和胸大肌重量顯著增加，腓腸肌重量雖增加但無(wú)顯著性差異；腹腔脂肪墊重量無(wú)顯著性變化。

表1 兩組小鼠體重、肌肉和腹腔脂肪墊重量比較

2.2 小鼠骨骼肌細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)

股四頭肌組織化學(xué)染色光鏡觀察結(jié)果顯示，對(duì)照組和His-Ms組小鼠肌細(xì)胞形態(tài)均正常，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整（圖2A）。與對(duì)照組比較，His-Ms組小鼠股四頭肌橫斷面積增加了5.6%，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2B），而股四頭肌每束肌纖維平均細(xì)胞數(shù)目?jī)山M之間無(wú)明顯差別（圖2C）。

2.3 小鼠血清指標(biāo)

表2顯示，各血清指標(biāo)兩組之間無(wú)顯著差別。

2.4 小鼠前肢抓力測(cè)試

正常對(duì)照組前肢抓力測(cè)試時(shí)間為33.5±2.7 s，His-Ms組為46.5±7.0 s，與正常對(duì)照組比較增加了26.6%，差異顯著（P<0.05）。

2.5 小鼠血清平均抗體滴度

表2 兩組小鼠血清指標(biāo)的變化

圖3顯示，在血清稀釋2×102倍時(shí)，對(duì)照組OD450nm值為0.363，His-Ms組 OD450nm值為 0.794，His-Ms組與對(duì)照組OD450nm比值大于2.1，由此判斷血清抗體為陽(yáng)性；而在血清稀釋2×103和2×104倍時(shí)，His-Ms組與對(duì)照組的OD450nm比值小于2.1，判斷血清抗體為陰性，表明His-Ms蛋白免疫小鼠后抗體效價(jià)達(dá)到2×102。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，針對(duì)Myostatin的免疫蛋白誘導(dǎo)的特異性抗體平均滴度在2×102以上，并對(duì)免疫小鼠體重、肌肉質(zhì)量和抓力均產(chǎn)生影響。與正常對(duì)照組比較，免疫小鼠體重平均增加了3.6%，股四頭肌、腓腸肌和胸大肌重量分別增加了11.2%、3.2%和15.8%，前肢抓力平均增加了26.6%，而小鼠腹腔游離脂肪組織和血清CHO、TG各組之間無(wú)明顯差別，推測(cè)免疫小鼠體重增加可能與肌肉重量增加有關(guān)，與脂肪堆積無(wú)明顯關(guān)聯(lián)。本實(shí)驗(yàn)中，與正常對(duì)照組比較，His-Ms組免疫小鼠股四頭肌橫斷面積增加了5.6%，而股四頭肌每束肌纖維平均細(xì)胞數(shù)目?jī)山M之間無(wú)明顯差別，初步表明免疫小鼠骨骼肌質(zhì)量增加可能與骨骼肌肥大有關(guān)，而與肌細(xì)胞增生無(wú)明顯關(guān)聯(lián)。Whittemore等［15］研究證明，成年小鼠注射抗Myostatin抗體后，肌肉質(zhì)量和抓力顯著增加，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。但Myostatin重組蛋白疫苗克服了抗體類藥物價(jià)格昂貴、用藥量大、長(zhǎng)期反復(fù)、易引起超敏反應(yīng)等缺點(diǎn)，是抑制體內(nèi)Myostatin活性的一種新途徑，易于在肌肉萎縮的臨床治療中應(yīng)用。我們前期有關(guān) Myostatin自體疫苗的制備及臨床前基礎(chǔ)研究成果已獲發(fā)明專利授權(quán)（No. 200610104728.4）。

本實(shí)驗(yàn)中，無(wú)活性Myostatin免疫蛋白使小鼠骨骼肌質(zhì)量和力量增加可能與免疫誘導(dǎo)的抗體和 Myostatin特異性結(jié)合進(jìn)而抑制其活性有關(guān)。Myostatin成熟肽包含9個(gè)保守的半胱氨酸殘基，在血液中通過(guò)二硫鍵連接形成二聚體，活化的Myostatin以二聚體形式與受體結(jié)合發(fā)揮該蛋白的生物學(xué)功能［16］。目前證實(shí)能與Myostatin成熟肽結(jié)合并抑制其活性的分子有其前肽、Follistatin、Follistatin-related gene（FLRG）及其受體Act RIIB拮抗劑等，肌肉表型與Myostatin基因敲除動(dòng)物的類似［9，17］。實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)的特異性抗體與 Myostatin 二聚體結(jié)合，可競(jìng)爭(zhēng)性抑制該分子與受體的結(jié)合而封閉其作用，相關(guān)的理論推測(cè)需要下一步競(jìng)爭(zhēng)性抑制實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)。

運(yùn)動(dòng)使骨骼肌負(fù)調(diào)控因子Myostatin基因表達(dá)趨于下調(diào)，同時(shí)促進(jìn)骨骼肌正調(diào)控因子IGF-I表達(dá)趨于上調(diào)［18，19］，但也有不一致的報(bào)道［3］。Zdanowicz等［20］利用IGF-I治療后肢懸吊10d的廢用性肌萎縮大鼠模型后發(fā)現(xiàn)，大鼠體質(zhì)量和肌質(zhì)量顯著恢復(fù)，對(duì)治療廢用性肌肉萎縮有效。而有關(guān)Myostatin在治療廢用性肌肉萎縮方面的研究仍少見，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為Myostatin靶分子應(yīng)用于廢用性等肌肉萎縮的治療提供了實(shí)驗(yàn)參考，并為航空航天醫(yī)學(xué)中研究失重性肌肉萎縮的難題提供了新思路。

4 總結(jié)

利用基因工程技術(shù)構(gòu)建、表達(dá)和純化的無(wú)活性His-Ms蛋白免疫小鼠后，可誘導(dǎo)其產(chǎn)生特異性抗體，使免疫小鼠瘦體重、骨骼肌質(zhì)量及抓力均有不同程度增加，表明Myostatin重組蛋白疫苗His-Ms是抑制體內(nèi)Myostatin活性的一種新途徑，對(duì)動(dòng)物骨骼肌質(zhì)量和力量增加有一定促進(jìn)作用。

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