3種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)對馬鈴薯試管苗生長和保存的影響

李 靜

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，河南鄭州450002)

馬鈴薯(Solanum tuberosum L.是茄科、茄屬)無性繁殖作物，是繼玉米、小麥和水稻之后的世界第4大糧食作物.由于馬鈴薯非中國原產(chǎn)作物，中國現(xiàn)有的馬鈴薯資源均為國外引進(jìn)和適應(yīng)性選擇保留品種，因此其遺傳背景較為狹窄［1］，這在一定程度上限制了馬鈴薯育種工作的進(jìn)展.近年來，國際間種質(zhì)資源的交流日益頻繁，馬鈴薯種質(zhì)資源引進(jìn)已成為國內(nèi)馬鈴薯育種工作的重要內(nèi)容之一，安全有效的種質(zhì)資源保存方法為種質(zhì)資源利用提供重要保障.組織培養(yǎng)是馬鈴薯快速繁殖和種質(zhì)保存的基本方法，采用馬鈴薯試管苗莖段進(jìn)行的離體培養(yǎng)和種質(zhì)保存技術(shù)較為成熟.然而，在以蔗糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中，馬鈴薯試管苗生長速度較快，需要定期進(jìn)行繼代繁殖，因而人工成本較高［2］.延緩馬鈴薯試管苗的生長速度可降低組培繼代次數(shù)，進(jìn)而節(jié)約人工成本.通過添加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)增大培養(yǎng)基中滲透壓，延緩馬鈴薯試管苗吸收營養(yǎng)物質(zhì)的速度，以減低試管苗生長速度，是降低種質(zhì)資源保存人工成本的有效途徑［3，4］.本研究通過蔗糖、甘露醇和聚乙二醇(PEG6000)3種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)對馬鈴薯試管苗生長的影響，以期為降低馬鈴薯種質(zhì)資源保存的人工成本提供參考和依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

以馬鈴薯(Solanaum tubersum L.)品種“鄭薯5號”的試管苗為材料，試管苗培養(yǎng)于附加30 g·L－1蔗糖的MS固體培養(yǎng)基中，選取生長比較一致的試管苗作起始材料，苗高(10±1)cm.試驗(yàn)所用的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)分別為蔗糖、甘露醇和PEG6000，均購自廣東汕頭市西隴化工廠.

1.2 接種與培養(yǎng)

切去試管苗頂端和基部帶芽節(jié)段，取中部單芽節(jié)段(長1 cm)，分別接種于添加不同質(zhì)量濃度蔗糖、PEG6000或甘露醇的MS培養(yǎng)基中.1)蔗糖:MS基本培養(yǎng)基中分別添加質(zhì)量濃度為0，30，60，90，120 g·L－1蔗糖;2)PEG6000:MS 基本培養(yǎng)基中分別添加質(zhì)量濃度為 0，20，40，60，80 g·L－1PEG6000，并附加20 g·L－1蔗糖;3)甘露醇:MS 培養(yǎng)基中分別添加 0，5，10，20，40 g·L－1甘露醇，并附加20 g·L－1蔗糖.配制好的培養(yǎng)基分裝于100 mL三角瓶中，每瓶35 mL，于滅菌鍋(121℃，1.04 kg·cm－2)滅菌15 min.每處理包括4～6個三角瓶，每瓶接種9個單芽節(jié)段.接種后的莖段培育于(25±1)℃的培養(yǎng)室中，光照度50～60 μm·m－2·s－1，光周期16 h/8 h，培養(yǎng)過程中材料不進(jìn)行繼代，每處理重復(fù)3次.

1.3 生長指標(biāo)的測定

接種的莖段培養(yǎng)90 d后統(tǒng)計(jì)各處理的存活率，并測量新生試管苗的株高、莖粗、節(jié)間長和單株鮮重.

1.4 遺傳穩(wěn)定性評價

采用CTAB小量法［5］抽提各處理的試管苗基因組DNA，利用已報道的RAPD引物［5］對試管苗基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增.PCR反應(yīng)在PTC－200型PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)體系為:1×buffer，50 ng模板 DNA，1.5 mmol·L－1MgCl2，200 μmol·L－1dNTPs，0.4 μmol·L－1引物，1 U Taq 酶.反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性5 min;94℃ 1 min，36℃ 1 min，72℃ 2 min，循環(huán)40次;72℃延伸8 min.PCR產(chǎn)物在加有0.5 mg·L－1EB的0.8%瓊脂糖凝膠中電泳分離，并在紫外透射儀上觀察、照相，統(tǒng)計(jì)各保存試管苗的多態(tài)性條帶數(shù)目.

2 結(jié)果與分析

2.1 蔗糖對馬鈴薯試管苗生長的影響

在組織培養(yǎng)中，蔗糖一方面為組織細(xì)胞的生長提供碳源，另一方面作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)維持細(xì)胞內(nèi)外的滲透平衡.在不加蔗糖的MS培養(yǎng)基上，馬鈴薯試管苗呈徒長趨勢，苗體纖細(xì)、瘦弱，且存活率隨著培養(yǎng)時間延長而下降.在添加30～120 g·L－1蔗糖的培養(yǎng)基上，試管苗的存活率幾乎達(dá)100%，但其生長情況隨蔗糖不同而呈現(xiàn)一定的差異(表1).隨著蔗糖的增加，試管苗株高、節(jié)間長、單株鮮重不斷下降，而莖粗有所增加，說明高蔗糖對馬鈴薯試管苗生長有抑制作用.120 g·L－1蔗糖對試管苗生長抑制效果最明顯，株高、節(jié)間長和單株中均為最低值，莖粗最大，但各項(xiàng)指標(biāo)與90 g·L－1蔗糖的抑制效果差異不顯著，說明90 g·L－1蔗糖即可達(dá)到抑制試管苗生長的效果.

表1 不同質(zhì)量濃度蔗糖對馬鈴薯試管苗生長的影響Table 1 Effects of different concentrations of sucrose on growth of potato test-tube plantlets

2.2 PEG6000對馬鈴薯試管苗生長的影響

PEG6000是常用的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，它可引起水分脅迫，從而導(dǎo)致試管苗形態(tài)的改變.由表2可知，在培養(yǎng)基中添加PEG6000后，馬鈴薯試管苗生長受到了抑制，其抑制程度與PEG6000質(zhì)量濃度有關(guān)，而不加PEG6000的培養(yǎng)基(對照)上植株生長正常.在添加20 g·L－1PEG6000的培養(yǎng)基上，馬鈴薯試管苗生長雖然受到了一定的抑制，但不如其它質(zhì)量濃度明顯.40 g·L－1明顯的抑制了試管苗的生長，其試管苗成活率雖有所下降(96.6%)，但與0 g·L－1差異不顯著，株高、莖粗、節(jié)間長和單株鮮重分別為 3.22 cm，0.65 mm，0.80 cm和40.44 mg，顯著低于對照的相應(yīng)指標(biāo).進(jìn)一步增大培養(yǎng)基中 PEG6000的質(zhì)量濃度(如 60，80 g·L－1)，盡管試管苗的株高、莖粗、節(jié)間長和單株鮮重均有所下降，但并不顯著，而且試管苗的存活率顯著降低，這可能導(dǎo)致所保存的種質(zhì)資源丟失.因此，40 g·L－1PEG6000最適宜于馬鈴薯試管苗的保存.

表2 不同質(zhì)量濃度PEG6000對馬鈴薯試管苗生長的影響Table 2 Effects of different concentrations of PEG6000 on growth of potato test-tube plantlets

2.3 甘露醇對馬鈴薯試管苗生長的影響

甘露醇是通過提高培養(yǎng)基中滲透壓來抑制培養(yǎng)物芽的生長和主芽伸長.由表3可知，隨著培養(yǎng)基中甘露醇質(zhì)量濃度不斷增大，馬鈴薯試管苗生長速度越來越緩慢，各項(xiàng)指標(biāo)均低于對照.其中，20 g·L－1處理的試管苗成活率為95.2%，與對照差異不顯著，株高、莖粗、節(jié)間長和單株鮮重顯著低于對照，說明20 g·L－1甘露醇盡管顯著抑制了試管苗生長，但對其成活率影響不大，適宜于馬鈴薯試管苗的保存.而40 g·L－1處理的試管苗的大部分形態(tài)指標(biāo)進(jìn)一步下降，生長速度有所減慢，且其成活率亦顯著降低，不利于馬鈴薯試管苗的保存.

表3 不同甘露醇對馬鈴薯試管苗生長的影響Table 3 Effects of different concentrations of mannitol on growth of potato test-tube plantlets

2.4 保存試管苗的遺傳穩(wěn)定性評價

比較分析表1～3可知，盡管較高的蔗糖、聚乙二醇和甘露醇均能延緩馬鈴薯試管苗的生長，但三者的抑制效果不盡一致.抑制效果最好的是PEG6000 40 g·L－1，其次為甘露醇 20 g·L－1，抑制效果最差的是蔗糖90 g·L－1.試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，保存于40 g·L－1PEG6000的試管苗在培養(yǎng)90 d后生長量較小，培養(yǎng)基并未耗盡，未出現(xiàn)植株生長不良的現(xiàn)象.而保存于90 g·L－1蔗糖和20 g·L－1甘露醇的試管苗由于培養(yǎng)基幾乎耗盡而生長較差.

圖1 RAPD引物S66的擴(kuò)增帶譜Fig.1 Band pattern produced by RAPD primer S66

為了評價各處理的試管苗的遺傳穩(wěn)定性，分別隨機(jī)選取19株保存于附加90 g·L－1蔗糖，40 g·L－1PEG和20 g·L－1甘露醇的培養(yǎng)基上試管苗，用于分析各單株的基因組變化情況.采用18個RAPD引物(S64～S345)對3種培養(yǎng)基上共57株試管苗基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)所有引物均能擴(kuò)增出清晰的帶譜，每條引物所擴(kuò)增的帶數(shù)為3～10條，18個引物共擴(kuò)增出146條，片段大小為200～3 000 bp.編號為S66的引物在保存于附加40 g·L－1PEG6000培養(yǎng)基的試管苗中的擴(kuò)增帶譜見圖1.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在所有單株中均未檢測到多態(tài)性條帶，說明在培養(yǎng)基中添加蔗糖、PEG6000和甘露醇不會導(dǎo)致馬鈴薯試管苗發(fā)生無性系變異，即3種保存方法均具有很好的安全性.

3 結(jié)論與討論

目前，在馬鈴薯種質(zhì)資源保存研究中，大多研究在培養(yǎng)基中添加生長抑制劑，如矮壯素(CCC)、比久(B9)、多效唑(PP333)、脫落酸(ABA)等［7，8］，以降低馬鈴薯試管苗生長速度，從而控制試管苗的生長速度，但這些生長抑制劑容易導(dǎo)致試管苗存活率降低，而致使種質(zhì)丟失.趙建萍等［7］發(fā)現(xiàn)添加20 mg·L－1B9或CCC的培養(yǎng)基中馬鈴薯試管苗繼代周期雖有所延長，但60 d時的存活率分別只有42%和68%.在培養(yǎng)基中添加一定的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，可降低試管苗吸收培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的速度，以避免生長抑制物質(zhì)對試管苗的強(qiáng)烈抑制作用而導(dǎo)致試管苗死亡.本研究采用蔗糖、PEG6000和甘露醇作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，均降低了馬鈴薯試管苗的生長速度，但對其存活率沒有影響.這說明滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)適宜于馬鈴薯種質(zhì)資源保存.

無性系變異是植物組織培養(yǎng)常見的現(xiàn)象，而對于種質(zhì)資源保存研究而言，無性系變異無疑是有害的，因?yàn)樗赡軐?dǎo)致種質(zhì)資源喪失優(yōu)良特性［8］.組織培養(yǎng)中高的生長抑制劑則容易導(dǎo)致無形系變異的發(fā)生［10］.徐君［11］認(rèn)為采用滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可避免高生長調(diào)節(jié)劑所引起的無性系變異.本研究采用RAPD標(biāo)記分析發(fā)現(xiàn)，保存于添加蔗糖、PEG6000和甘露醇的培養(yǎng)基上的馬鈴薯試管苗，未擴(kuò)增出多態(tài)性片段，即沒有發(fā)生無性系變異，說明這3種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可安全的用于馬鈴薯種質(zhì)保存.

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