玉米組氨酸三聚體核苷結(jié)合蛋白基因Zm-HINT 1的克隆及其原核表達(dá)載體構(gòu)建

吳劉記，吳連成，祖小峰，王平安，陳彥惠

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南鄭州450002)

組氨酸三聚體核苷結(jié)合蛋白(Histidine triad nucleotide binding protein，HINT 1)是組氨酸三聚體蛋白超家族的成員，是一個(gè)具有核苷酸轉(zhuǎn)移酶和水解酶活性的家族，晶體結(jié)構(gòu)研究結(jié)果表明，HINT 1是其他4種組氨酸三聚體蛋白超家族成員的祖先，參與了重要的生物學(xué)功能.自從HINT 1首次在牛中被分離出來并被證明具有生物學(xué)功能后［1］，許多HINT 1的同源物也依次從兔、人中被克隆出來，并開展了相關(guān)研究，尤其是HINT在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用［2，3］.但是目前尚沒有關(guān)于植物 HINT的功能研究，尤其是尚未見到關(guān)于玉米HINT的研究報(bào)道.玉米既是中國重要的經(jīng)濟(jì)作物，同時(shí)也是基礎(chǔ)研究領(lǐng)域的模式物種［4］，為了進(jìn)一步揭示植物HINT的功能，本研究以玉米作為研究載體，通過電子克隆方法和RT－PCR技術(shù)克隆了玉米黃早4 HINT 1基因的cDNA序列，并構(gòu)建了其原核表達(dá)載體，為玉米HINT1理化性質(zhì)及生理功能的研究奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

溫帶玉米自交系材料黃早4種子由國家玉米改良中心鄭州分中心實(shí)驗(yàn)室保存，溫室內(nèi)培養(yǎng)，待長到4片葉時(shí)進(jìn)行取樣.

1.2 主要試劑及菌株

TRIzol試劑(invitrogen公司)，RT－PCR kit、T載體、DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(DL 2000)均購自Takara公司，AxyPrepTMDNA Gel Extraction Kit(Axygen公司)，EcoRI和 XhoI限制性內(nèi)切酶、T4連接酶(Takara公司)，PET－28a表達(dá)載體購自Novagen公司.

1.3 引物設(shè)計(jì)和合成

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫Genbank中人和小鼠HINT 1基因比對(duì)，通過電子克隆的方法設(shè)計(jì)黃早4 HINT 1基因的cDNA全長序列擴(kuò)增引物5’-ATTTATCGTT TATCCACGGA-3’和 5’-GAGCAGATCAGCAAGGC CA-3’進(jìn)一步克隆測序，根據(jù)黃早4 HINT 1基因的編碼框序列，設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)(EcoRI和XhoI限制性內(nèi)切酶)的引物序列:5’-ACGAATTCATGTCGTCGGAGAAGGAGGC-3’和 5’-ACCTCGAG TTAGCCTGGGGGCCAGTTCA-3’，用于原核表達(dá)載體的構(gòu)建.

1.4 總RNA的制備及cDNA的合成擴(kuò)增

總RNA的制備按照TRIzol試劑的操作說明進(jìn)行，然后利用制備的RNA，按照RT－PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說明進(jìn)行cDNA的合成反應(yīng).

1.5 PCR產(chǎn)物連接與轉(zhuǎn)化

將PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收和純化后，采用T－A克隆方法，和PMD－18T載體按一定比例連接過夜;然后將10 μL連接產(chǎn)物進(jìn)行克隆轉(zhuǎn)化.

1.6 菌液PCR鑒定陽性克隆、測序分析

挑選陽性菌斑，接種于LB(Luria-Bertani)液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)4 h后，吸取1 μL菌液作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，并將陽性克隆送上海英俊公司進(jìn)行測序.

1.7 原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

以黃早4 cDNA為模板擴(kuò)增HINT 1編碼區(qū)，PCR產(chǎn)物分別連入PMD－18T載體，進(jìn)行克隆轉(zhuǎn)化，挑選若干個(gè)克隆進(jìn)行PCR鑒定及測序鑒定.同時(shí)將PCR陽性克隆產(chǎn)物進(jìn)行EcoRI，XhoI限制性內(nèi)切酶雙酶切，連入經(jīng)過同樣雙酶切的表達(dá)載體的相應(yīng)位點(diǎn)上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TGⅠ.PCR篩選陽性克隆，經(jīng)測序鑒定獲得重組質(zhì)粒PET－HINT 1.

2 結(jié)果與分析

2.1 黃早4 HINT 1基因的cDNA擴(kuò)增

根據(jù)數(shù)據(jù)庫中HINT 1基因的同源序列設(shè)計(jì)引物，以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增黃早4 HINT 1基因的cDNA，結(jié)果如圖1所示:PCR擴(kuò)增出了1條大小約729 bp的片段，同時(shí)陰性對(duì)照(以蒸餾水作為PCR反應(yīng)模板)沒有條帶，說明用于擴(kuò)增的PCR引物有很好的特異性.

圖1 PCR產(chǎn)物凝膠電泳分析Fig.1 1%agarose gel electrophoresis of PCR product

2.2 黃早4 HINT 1基因的序列分析

黃早4 HINT 1經(jīng)克隆測序后所得的核苷酸序列如圖2－A所示，編碼的氨基酸序列如圖2－B.其全長cDNA序列為729 bp，編碼框?yàn)?87 bp，編碼129個(gè)氨基酸.5’和3’端分別包含1個(gè)66和276 bp的非編碼區(qū).Poly(A)信號(hào)位于 3’UTR 708～729 bp處.氨基酸序列分析結(jié)果表明，該蛋白的預(yù)測相對(duì)分子質(zhì)量是14.23 kD，等電點(diǎn)是5.99.和其他物種HINT 1氨基酸序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，黃早4 HINT 1包含保守的活性位點(diǎn)區(qū)域，包括HIT基序，折疊區(qū)，這些保守的區(qū)域是HINT 1蛋白家族的重要特征.此蛋白和人HINT 1、小鼠HINT 1、鮑魚 HINT 1比對(duì)的相似度分別為 61.6%，61.6%和45.7%(圖3).

2.3 黃早4 HINT 1基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建

以黃早4 cDNA為模板，用加有酶切位點(diǎn)(EcoRI，XhoI限制性內(nèi)切酶)的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到387 bp左右大小的特異性條帶，與預(yù)期的產(chǎn)物大小一致(圖 4).將 PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoRI，XhoI限制性內(nèi)切酶酶切，同時(shí)，將PET－28a表達(dá)載體經(jīng)相同的酶切(圖5)，回收目的基因及載體酶切后片段，經(jīng)連接酶16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行克隆分析.

2.4 黃早4 HINT 1基因原核表達(dá)重組質(zhì)粒的鑒定

用PCR反應(yīng)篩選菌斑，鑒定重組質(zhì)粒陽性克隆，結(jié)果如圖6所示.隨意挑選的5個(gè)菌斑均呈陽性克隆，說明重組基因載體構(gòu)建中的連接效率比較高.任意選取其中2個(gè)將陽性克隆進(jìn)一步測序驗(yàn)證，結(jié)果如圖7所示，2個(gè)測序結(jié)果完全一致且沒有移碼現(xiàn)象，可用于下一步的誘導(dǎo)表達(dá)，該重組質(zhì)粒命名為PET－HINT 1.

3 討論

圖2 黃早4 HINT 1基因核苷酸及氨基酸序列Fig.2 Nucleotide and amino acid sequences of HINT 1 of Huangzao 4

圖3 黃早4 HINT 1與人、小鼠、鮑魚HITN 1氨基酸序列對(duì)比Fig.3 Alignments of the Zm-HINT 1 amino acid sequences with that of Homo sapiens HINT 1，Rattus norvegicus HINT 1 and abalone HINT 1

研究表明，HINT 1在低等動(dòng)物和高等動(dòng)物中具有很高的結(jié)構(gòu)和功能保守性，而結(jié)構(gòu)和功能的保守性，預(yù)示了HINT 1在生物體內(nèi)發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能.后續(xù)的研究也陸續(xù)證明了HINT 1蛋白參與了物質(zhì)代謝、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞生長、細(xì)胞凋亡等［5］重要的生物學(xué)進(jìn)程.同時(shí)，目前有研究報(bào)道了關(guān)于哺乳動(dòng)物HINT 1在腫瘤細(xì)胞凋亡、腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要作用［6］，雖然具體的功能機(jī)制尚不清楚，但是為其用于腫瘤治療提供了一定的理論依據(jù)，將成為科學(xué)家進(jìn)一步研究的熱點(diǎn).相對(duì)脊椎動(dòng)物HINT 1的研究，對(duì)其他物種HINT 1的研究還比較缺乏，目前的報(bào)道也只是停留在利用基因組和蛋白質(zhì)組的方法，得到相關(guān)基因序列.如LIU等［7］報(bào)道了日本血吸蟲 Schistosoma japonicum的HINT 1 序 列，SWINGLEY 等［8］報(bào)道 了藍(lán)藻 菌Acaryochloris marina的 HINT 1序列，在植物中，HINT 1的功能研究更有待于進(jìn)一步探討［9］.

圖7 測序鑒定重組質(zhì)粒Fig.7 Identification of recombinant plasmid by sequencing

本研究通過同源克隆的方法，獲得了玉米黃早4 HINT 1的全長cDNA序列及相應(yīng)編碼的氨基酸序列.序列分析結(jié)果表明該基因全長cDNA為729 bp，包含了387 bp的編碼框序列，編碼129個(gè)氨基酸.氨基酸序列分析結(jié)果表明，該蛋白的預(yù)測分子量是14.23 kD，等電點(diǎn)是 5.99.與國家玉米改良中心鄭州分中心實(shí)驗(yàn)室在熱帶玉米自交系材料CML 288中所克隆的HINT 1基因相比，基因序列完全一致，說明了HINT 1基因序列的保守性，也間接暗示了該基因在功能上的保守性.為了進(jìn)一步探索研究玉米HINT 1基因的功能，作者構(gòu)建了HINT 1的原核表達(dá)載體，該原核表達(dá)載體是大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)里最為常用的載體之一，具有能夠在體外進(jìn)行可溶性表達(dá)及表達(dá)量較高的特點(diǎn).同時(shí)，利用該表達(dá)載體上帶有6×Histag表達(dá)標(biāo)簽，使得表達(dá)出來的融合蛋白能夠直接利用Ni-NTA親和層析柱進(jìn)行純化操作，也可以利用His單克隆抗體進(jìn)行western blot免疫雜交反應(yīng)，進(jìn)而對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行檢測鑒定.總之，本研究克隆了玉米黃早4 HINT 1基因，同時(shí)構(gòu)建了HINT 1的原核表達(dá)載體，為玉米HINT 1的功能研究奠定了基礎(chǔ).

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