乳腺癌細(xì)胞腫瘤標(biāo)記物表達(dá)及其與臨床病理特征相關(guān)性研究

王瑾 鄭芹 楊惠玲

乳腺癌細(xì)胞腫瘤標(biāo)記物表達(dá)及其與臨床病理特征相關(guān)性研究

王瑾 鄭芹 楊惠玲

目的探討腫瘤標(biāo)記物14-3-3σ、Akt和p27Kip1蛋白在乳腺癌中的表達(dá)及其與臨床病理特征及Her-2的相關(guān)性。方法選取43份乳腺癌石蠟標(biāo)本和10份正常乳腺組織標(biāo)本，采用免疫組織化學(xué)技術(shù)( SABC )檢測(cè)組織中14-3-3σ、Akt和p27Kip1蛋白的表達(dá)，結(jié)合臨床資料和隨訪資料，進(jìn)行回顧性研究，作出評(píng)估。統(tǒng)計(jì)學(xué)采用 Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)或 Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)，并采用 Kaplan Meier 法進(jìn)行單因素生存分析。結(jié)果14-3-3σ、Akt可表達(dá)于細(xì)胞胞漿，而p27Kip1蛋白可表達(dá)于細(xì)胞胞漿或（和）胞核。胞漿14-3-3σ、Akt或p27Kip1蛋白胞漿表達(dá)均與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期呈正相關(guān)（P ＜ 0.01或P ＜ 0.05），并提示生存相對(duì)較差，p27Kip1蛋白胞漿錯(cuò)誤定位的患者預(yù)后不良。Her-2蛋白可能對(duì)PI3k-Akt和p27Kip1通路參與乳腺癌致病起到一定作用。結(jié)論14-3-3σ、Akt或p27Kip1蛋白可作為判斷乳腺癌淋巴轉(zhuǎn)移和預(yù)后評(píng)估的有效指標(biāo)。

乳腺癌；腫瘤標(biāo)記物；14-3-3σ 蛋白；Akt 蛋白；p27Kip1蛋白

乳腺癌(breast cancer)是嚴(yán)重威脅婦女健康的一種惡性腫瘤。目前，乳腺癌發(fā)病率已躍居我國(guó)婦女癌癥發(fā)病首位[1]。以癌基因( oncogene )或抑癌基因( tumor suppressor gene )作為腫瘤標(biāo)記物已取得很大進(jìn)展，它通過檢測(cè)各種癌基因和突變的抑癌基因及其產(chǎn)物，為腫瘤的診斷和進(jìn)一步治療提供依據(jù)。14-3-3σ 蛋白是一種分子伴侶，Akt 蛋白是一種蛋白激酶，p27Kip1蛋白是細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控因子。不同的研究表明它們的表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在密切關(guān)系，并且它們之間有相互調(diào)節(jié)和(或)制約作用。本研究應(yīng)用免疫組化法對(duì)Akt、p27Kip1及 14-3-3σ 蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)其與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系及生存時(shí)間進(jìn)行分析，以探討其在乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展中的作用。

資料與方法

一、一般資料

篩查中山大學(xué)腫瘤防治中心2002年全年乳腺癌患者的資料，從中選擇了43例根治性手術(shù)切除的乳腺癌石蠟標(biāo)本；另外選取10例癌旁正常乳腺組織石蠟切片作對(duì)照。病例選取的條件包括：患者術(shù)前均未行放、化療，術(shù)后均有明確的病理學(xué)診斷；年齡27 ～ 73歲，中位年齡47.0歲。根據(jù)2002年國(guó)際抗癌聯(lián)盟 （UICC）的TNM分期法：T1（腫瘤最大徑≤2 cm）11例，T2（腫瘤最大徑＞ 2 cm，但≤5 cm）17例，T3（腫瘤最大徑＞ 5 cm）12 例，T4[任何大小腫瘤，直接擴(kuò)散到胸壁和皮膚（胸壁包括肋骨、肋間肌和前鋸肌，不包括胸肌）]3例；N0（無區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）20例，N1-3（有同側(cè)或?qū)?cè)區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）23例；所取標(biāo)本均無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。Ⅰ期6例，Ⅱ期 （Ⅱa+Ⅱb）26例，Ⅲ期 （ Ⅲa+Ⅲb+Ⅲc ）11例。

二、方法

Akt鼠抗人抗體購(gòu)自 Cell Signaling 公司，p27Kip1兔多抗抗體及14-3-3σ山羊多抗抗體購(gòu)Santa Cruz 公司，二抗及DAB顯色試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

標(biāo)本經(jīng)4﹪甲醛溶液固定，石蠟包埋，4 μm切片，免疫組化 SABC 法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)步驟按說明書進(jìn)行?？乖捎酶邷馗邏盒迯?fù)，用已知的陽(yáng)性乳腺癌切片作陽(yáng)性對(duì)照，用 PBS 取代一抗作陰性對(duì)照。

三、結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)

14-3-3σ、Akt蛋白陽(yáng)性著色為粗細(xì)不一的棕黃顆粒，主要定位于腫瘤細(xì)胞胞漿中；p27Kip1定位于腫瘤細(xì)胞核和（或）胞漿。染色按陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占腫瘤細(xì)胞的比例進(jìn)行分級(jí)[2-4]。Akt陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) ＜ 10﹪為（-），10﹪ ～ 50﹪為（+），＞ 50﹪為（+ +）；P27Kip1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜ 5﹪為（-），5﹪ ～ 50﹪為（+），＞ 50﹪為（+ +）；14-3-3σ 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) ＜ 10﹪為（-），10﹪ ～ 50﹪為（+），50﹪ ～ 75﹪為（+ +），＞ 75﹪為（+ + +）。

四、統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料分析組間相關(guān)采用秩和分析，同時(shí)進(jìn)行Kaplan Meier 生存分析。以P ＜ 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

結(jié) 果

一、通過采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與正常乳腺組織相比，在乳腺癌組織中 14-3-3σ、Akt 蛋白過表達(dá)，且定位于細(xì)胞漿（圖1，2）；p27Kip1蛋白為細(xì)胞核和（或）細(xì)胞漿表達(dá)(圖3，4）。

二、采用 Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)或 Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)(表1)，分析發(fā)現(xiàn)胞漿 14-3-3σ、Akt蛋白或 p27Kip1蛋白胞漿表達(dá)均與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期呈正相關(guān)；應(yīng)用 Kaplan Meier 法進(jìn)行單因素生存分析并所繪制5年生存曲線結(jié)果表明（圖5，6）胞漿 14-3-3σ、Akt 蛋白過表達(dá)的病人生存期相對(duì)較短，p27Kip1蛋白胞漿錯(cuò)誤定位的患者預(yù)后不良。

圖1 14-3-3σ 蛋白在乳腺癌中表達(dá)（×200）

圖2 Akt 蛋白在乳腺癌中表達(dá)（×200）

圖3 p27Kip1蛋白在乳腺癌細(xì)胞漿中表達(dá)（×200）

圖4 p27Kip1蛋白在乳腺癌細(xì)胞核中表達(dá)（×400）

表1 14-3-3σ、Akt 和 p27Kip1蛋白表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征相關(guān)性分析（例）

圖5 14-3-3σ 蛋白表達(dá)水平與生存時(shí)間( Kaplan-Meier 生存曲線)

圖6 Akt 蛋白表達(dá)水平與生存時(shí)間( Kaplan-Meier 生存曲線)

三、通過比較 14-3-3σ、Akt、p27Kip1蛋白與 Her-2的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，與 Her-2 陰性組比較，Her-2 陽(yáng)性組的14-3-3σ、Akt 蛋白表達(dá)升高；而胞核 p27Kip1蛋白表達(dá)降低，胞漿表達(dá)水平升高；

四、Akt 與 ER 呈正相關(guān)，胞漿 p27Kip1蛋白表達(dá)與 PR 呈正相關(guān)，提示 PI3K/Akt 通路可能參與雌激素類蛋白表達(dá)，但具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。同時(shí)，胞漿 Akt 和胞漿 p27Kip1表達(dá)水平與 VEGF 呈正相關(guān)，提示在 VEGF 促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和抗凋亡的功能中，Akt蛋白和 p27Kip1蛋白可能發(fā)揮一定的作用。

討 論

一、14-3-3σ 蛋白，又稱人乳腺癌上皮標(biāo)志物-1(human mammary epithelial marker 1, HEM1)[5]，是目前研究的所有14-3-3蛋白各亞型中與腫瘤關(guān)系最為密切的亞型[6]。Mong-Hong Lee等[7]在乳腺癌細(xì)胞株的研究發(fā)現(xiàn) 14-3-3σ 可以與 p53 結(jié)合穩(wěn)定其表達(dá)，抑制其降解過程，提高其轉(zhuǎn)錄活性，使細(xì)胞周期阻滯在G2/M 期，從而抑制腫瘤增殖。

本研究是通過免疫組織化學(xué)方法檢測(cè) 14-3-3σ 在乳腺癌組織中和正常乳腺組織中的表達(dá)情況，結(jié)果為14-3-3σ 蛋白在乳腺癌組織中表達(dá)是過量的。這一結(jié)果與多數(shù)研究中所報(bào)道的 14-3-3σ 蛋白在多種腫瘤中表達(dá)下降并不一致，其中有報(bào)道認(rèn)為 14-3-3σ 蛋白在乳腺癌的表達(dá)增加[8]，而 Moreira 等[9]曾報(bào)道 14-3-3σ在乳腺癌表達(dá)下調(diào)只是偶發(fā)事件(表達(dá)缺失率3/68)。但多數(shù)報(bào)道支持由于 14-3-3σ 啟動(dòng)了 CpG 島甲基化而導(dǎo)致在乳腺癌中該基因沉默[10]。但在此研究中14-3-3σ蛋白在Her-2陽(yáng)性組織中表達(dá)增強(qiáng),是否提示著14-3-3σ蛋白在Akt蛋白增加而p27Kip1蛋白降低情況下出現(xiàn)代償性增高作用，14-3-3σ 蛋白的表達(dá)與腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移，TMN 分期有關(guān)，且隨臨床分期的增高，14-3-3σ 蛋白表達(dá)明顯增高。這些均提示 14-3-3σ 蛋白在乳腺癌中的表達(dá)增多可能是一個(gè)預(yù)后不佳的潛在因素。生存曲線顯示隨 14-3-3σ 蛋白表達(dá)增強(qiáng)，生存率出現(xiàn)下降趨勢(shì)。

二、Akt蛋白，又稱為蛋白激酶B ( protein kinase B, PKB )，是一種絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，是磷脂酰肌醇-3-激酶( phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K )下游的直接靶蛋白，Akt 的活化依賴于 PI3K 對(duì)含有肌醇的膜磷脂酰肌醇環(huán)上3位羥基的特異磷酸化[11]。Akt 可通過多種途徑或作用多種因子促進(jìn)調(diào)亡。例如，Akt 可以作用于下游的凋亡蛋白 Bad，使其磷酸化，抑制其促凋亡作用[12]；Akt 磷酸化 Forkhead 蛋白家族，促進(jìn) Forkhead 蛋白離開細(xì)胞核，從而抑制促凋亡基因轉(zhuǎn)錄[13]；Akt 可催化 MDM2 的 Ser166 和 Ser188 磷酸化，而磷酸化的 MDM2更有效地轉(zhuǎn)到核內(nèi)，促使p53降解[14]，從而抑制凋亡。此外，Akt 參與多種途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的進(jìn)程，如 Akt 可磷酸化細(xì)胞周期抑制物P27Kip1使其失活，阻止 P27Kip1進(jìn)入細(xì)胞核從而抑制P27Kip1介導(dǎo)的 G1 期阻滯，促進(jìn)增殖[15]。

本研究顯示乳腺癌中 Akt 蛋白在乳腺癌組織中高表達(dá)。此外，本研究對(duì)臨床病理資料進(jìn)行分析，Akt 與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期顯著相關(guān)。這說明 Akt 可能與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，可用于臨床乳腺癌病情和治療的判斷。對(duì)于生存分析，生存曲線顯示了Akt 過表達(dá)的患者5年的生存率低于其表達(dá)陰性的患者。

三、p27Kip1蛋白，腫瘤的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞周期調(diào)控異常關(guān)系密切。細(xì)胞周期由正調(diào)控因子細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶(cyclin-dependent kinase, CDK)和負(fù)調(diào)控因子CDK抑制因子(CDK inhibitor, CKI)共同作用而精切調(diào)控。p27Kip1為 CKI 兩大家族之一的成員，p27Kip1定位于染色體12p13，主要通過對(duì)細(xì)胞周期從G1 期到S期的轉(zhuǎn)換抑制來抑制細(xì)胞增殖，其主要通過抑制多種 Cyclin-CDKs復(fù)合物(如cyclinE/CDK2, cyclinD1/CDK4復(fù)合物)的活性來實(shí)現(xiàn)其對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控，它可抑制多種 Cyclin-CDKs 復(fù)合物的活性，對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行負(fù)調(diào)控，抑制細(xì)胞分裂和增殖，促進(jìn)細(xì)胞分化和凋亡[16]。

p27Kip1蛋白發(fā)揮活性的區(qū)域在細(xì)胞核，當(dāng) p27Kip1蛋白自身被磷酸化后，磷酸化的 p27Kip1從細(xì)胞核轉(zhuǎn)入細(xì)胞漿，在細(xì)胞漿內(nèi)通過泛素化-蛋白水解途徑水解失活[17]。本研究檢測(cè) p27Kip1蛋白在乳腺癌組織的胞核表達(dá)率低于正常乳腺組織核表達(dá)。同時(shí)在胞漿表達(dá)豐富，高于正常乳腺組織胞漿表達(dá)。由此說明，p27Kip1可在胞漿和胞核表達(dá)，但對(duì)于腫瘤組織，由于磷酸化的 p27Kip1從胞核泄漏入胞漿，使得胞漿表達(dá)增加。實(shí)驗(yàn)表明，p27Kip1蛋白與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期有密切關(guān)系，與腫瘤大小無關(guān)。p27Kip1蛋白胞核表達(dá)降低及胞漿表達(dá)增加，可提示 p27Kip1蛋白從核泄入漿的量增多，造成 p27Kip1泛素化失活，從而失去抑制腫瘤的功能。p27Kip1蛋白的核漿定位顛倒可用于提示乳腺癌的發(fā)展程度。生存曲線顯示了錯(cuò)誤的核漿定位可能將不利于乳腺癌的預(yù)后。

四、乳腺癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多階段和多步驟的復(fù)雜過程，其中涉及眾多癌基因和抑癌基因失衡、信號(hào)通路傳導(dǎo)異常和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的改變等。PI3k-Akt 和 p27Kip1通路參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，并在細(xì)胞膜Her-2 蛋白參與下發(fā)揮作用（圖7）。實(shí)驗(yàn)表明，在 Her-2 陰性(缺失狀態(tài))的乳腺癌組織中 Akt 蛋白的表達(dá)水平低于其在 Her-2 陽(yáng)性組織中，提示 Her-2 存在情況下，Akt 蛋白表達(dá)增加，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。同時(shí) p27Kip1蛋白的胞核表達(dá)在 Her-2 陽(yáng)性乳腺癌組織中也降低，而胞漿組織 p27Kip1蛋白表達(dá)水平升高，促進(jìn) p27Kip1蛋白從胞核到胞漿的釋放和降解，失去抑制腫瘤的作用。以上提示，Her-2 蛋白存在或者缺失可能對(duì) PI3k-Akt 和 p27Kip1通路有直接影響。14-3-3σ 蛋白在 Her-2 陽(yáng)性組織中表達(dá)增強(qiáng)，其水平高于在 Her-2 陰性的乳腺癌組織中。根據(jù)以往的研究，14-3-3σ 作為一種抑癌基因可直接抑制Akt的表達(dá)，從而增強(qiáng) p27Kip1蛋白的細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控作用；也可以增加 p27Kip1蛋白的穩(wěn)定性，阻止 p27Kip1蛋白出核發(fā)生降解[18]。但在此研究中 14-3-3σ 蛋白在 Her-2 陽(yáng)性組織中表達(dá)增強(qiáng)，是否提示著 14-3-3σ 蛋白在Akt蛋白增加而 p27Kip1蛋白降低情況下出現(xiàn)代償性增高作用、還是一種異常的反應(yīng)、或者存在另外的蛋白分子影響其表達(dá)?這些需進(jìn)一步探討。

圖7 Her-2 與 PI3K-Akt 通路在乳腺癌發(fā)病機(jī)制中作用

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Expression of three tumor markers in breast cancer tissue and its association with pathological characteristics

WANG Jin, ZHENG Qin, YANG Hui-ling. Department of Pathophysiology, Medical School, Sun Yat-sen University, GuangZhou 510080, China

YANG Hui-ling, E-mail: yanghl@mail.sysu.edu.cn

ObjectiveTo investigate the expressions of 14-3-3σ, Akt and p27Kip1proteins in breast cancer, and evaluate their relations with clinicopathologic status and Her-2 protein.MethodsExpressions of 14-3-3σ, Akt and p27Kip1proteins were examined by immunohistochemistry (SABC) method and the retrospective analysis was conducted based on clinical data and follow-up.ResultsHigh-level expression of 14-3-3σ.Akt or p27Kip1protein in cytoplasm positively correlated with lymph nodal metastasis and TNM stage (P ＜ 0.01 or P ＜ 0.05), and probably predicted a poor prognosis; Her-2 protein may contribute to tumorigenesis and development of breast cancer mediated by PI3k-Akt and p27Kip1pathway.Conclusion14-3-3σ、Akt and p27Kip1proteins may serve as useful markers to predict lymph nodemetastasis and to evaluate prognosis of patients with breast cancer.

Breast cancer；Tumor marker；14-3-3σ protein；Akt protein；p27Kip1protein

2011-03-07)

(本文編輯:蔡曉珍)

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2011.01.011

510080 廣州，中山大學(xué)病理生理學(xué)教研室

楊惠玲，E-mail：yanghl@mail.sysu.edu.cn

王瑾,鄭芹,楊惠玲.乳腺癌細(xì)胞腫瘤標(biāo)記物表達(dá)及其與臨床病理特征相關(guān)性研究[J/CD]. 中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志: 電子版, 2011, 1(1): 74-80.