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    人類白細(xì)胞抗原半相合供者外周血細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞治療晚期原發(fā)性肝癌二例

    2011-12-06 03:33:12葉扶光許怡薇姚尚志張鑫肖漓馬錫慧高鈺馮凱石炳毅
    關(guān)鍵詞:配型供者回輸

    葉扶光 許怡薇 姚尚志 張鑫 肖漓 馬錫慧 高鈺 馮凱 石炳毅

    細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine induced killer cells,CIK)是一種新型免疫活性細(xì)胞。其兼有 T 細(xì)胞抗瘤活性和自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell,NK)非主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex,MHC)限性殺瘤的特點(diǎn),殺傷活性可達(dá) 84.7﹪[1]。與淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞( lymphokine-activated killer,LAK )和腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞( tumor infiltrating lymphocyte,TIL )相比,CIK 具增殖速度快、殺瘤活性高、殺瘤譜廣和毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)[2]。實(shí)驗(yàn)證實(shí),同正常人的 CIK 相比,肝癌患者 CIK 的增殖速度較慢且增殖倍數(shù)也有所降低[3]。晚期肝癌患者耐受力差,且患者自體淋巴細(xì)胞往往存在嚴(yán)重的免疫抑制,直接影響自體過繼性免疫治療的效果。所以我們?yōu)?例晚期肝癌患者回輸取自人類白細(xì)胞抗原( human leucocyte antigen,HLA )配型半相合直系親屬健康供者的單個(gè)核細(xì)胞所培養(yǎng)獲得CIK細(xì)胞,回輸于患者用于其肝癌治療?,F(xiàn)就其近期療效報(bào)道如下。

    資料與方法

    一、病例選擇

    于2010年7月至2010年9月于解放軍第三〇九醫(yī)院器官移植中心細(xì)胞治療科診治的2例肝癌患者。診斷符合 1999 年第 4 屆全國肝癌學(xué)術(shù)會(huì)議通過的原發(fā)性肝癌診斷標(biāo)準(zhǔn)診斷,且CIK細(xì)胞治療與其他治療間隔4周以上。

    患者1:男性 33 歲,經(jīng)影像學(xué)、細(xì)胞學(xué)及病理學(xué)檢查確診,在行CIK治療前行3次介入栓塞化療,1次全身化療,治療無明顯效果?;颊吒闻K彌漫性占位病變,門靜脈主干及其分支癌栓形成、海綿狀門脈,兩肺多發(fā)轉(zhuǎn)移,脾大,肝硬化。

    患者2:男性 48 歲,經(jīng)影像學(xué)、細(xì)胞學(xué)及病理學(xué)檢查確診,在行 CIK 治療前行3次介入栓塞化療,手術(shù)1次。肝癌根除術(shù)后復(fù)發(fā),患者肝多發(fā)占位,肝硬化,腹水,脾大,黃疸。

    二、供者選擇

    患者1供者為其親生父親,患者2供者為其親生女,兩供者均經(jīng)HLA配型證實(shí)與受者HLA配型為半相合

    三、CIK 細(xì)胞制備

    采用費(fèi)森尤斯細(xì)胞分離機(jī)循環(huán)5000ml之后的健康供者 PBMC 用 Ficoll 分離并收集單個(gè)核細(xì)胞,用 RPM I -1640洗滌 3次,按 2×106/ml 懸浮于RPM I-1640完全培養(yǎng)基中。參照美國斯坦福大學(xué)骨髓移植中心建立的 CIK 細(xì)胞培養(yǎng)方法:第0天加入IFN-γ 500 U/ml,置于37 ℃,5﹪CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,第1天加入IL-2300 U/ml,CD310 μg/L,IL-1100 U/ml繼續(xù)培養(yǎng),每天觀察細(xì)胞生長并根據(jù)情況進(jìn)行擴(kuò)增。以后每 3 d換液 1次并調(diào)整細(xì)胞數(shù)為(1~2)×109/L,在37℃,5﹪ CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)10~12 d后計(jì)數(shù)。CIK 細(xì)胞培養(yǎng)14~28 d后,取少量培養(yǎng)細(xì)胞做免疫組化檢測,當(dāng) CD3+、CD56+細(xì)胞數(shù)≥65﹪,CD3+、CD8+細(xì)胞≥35﹪,且微生物學(xué)檢查陰性時(shí)收集細(xì)胞。

    四、CIK 免疫表型檢測

    在 CIK 培養(yǎng)的第 0 天和第 14 天分別抽取少量細(xì)胞,用流式細(xì)胞儀行免疫表型分析,查 CD3+/CD56+及 CD3+/CD8+細(xì)胞比例。

    五、CIK 細(xì)胞回輸

    分 3次回輸于患者,每次間隔1d,一次回輸量為 1×109~1.5×1010?;剌斖惶扉_始靜脈輸注IL-2200萬U,連續(xù)14 d。

    六、療效觀察

    分別檢測患者治療前后的臨床癥狀變化;堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,ASP)變化;卡氏評(píng)分改變;甲胎蛋白(Alphafetoprotein,AFP)及CA199的改變。

    七、毒副作用觀察

    觀察患者是否有發(fā)熱、寒戰(zhàn)和血壓降低等。

    結(jié) 果

    一、CIK免疫表型

    第0天2例供者CD3+、CD56+細(xì)胞分別約占3.4﹪及 5.1﹪,CD3+、CD8+細(xì)胞約占 23.2﹪及28.8﹪;第14天 CD3+、CD56+細(xì)胞約占 10.4﹪及23.4﹪,CD3+、CD8+細(xì)胞約占 47.2﹪及 80.5﹪。

    二、療效觀察

    2例患者接受 CIK 治療后食欲、體力均較前有好轉(zhuǎn),體重增加,肝區(qū)疼痛減輕,腹腔積液減少,黃疸減輕。復(fù)查 CT 腫瘤均有不同程度縮小,較治療前卡氏評(píng)分提高分別提高15分和20分,腫瘤標(biāo)志物及肝功能變化見表1。

    表1 CIK 細(xì)胞治療前后腫瘤標(biāo)志物及肝功變化

    三、毒副反應(yīng)

    患者1第一次輸注 CIK 細(xì)胞后曾出現(xiàn)一過性發(fā)熱,給予對(duì)癥退熱后好轉(zhuǎn)。后 2次輸注過程順利,在不服用退熱藥情況下2h后體溫恢復(fù)正常?;颊?2 在輸注 CIK 細(xì)胞后出現(xiàn)呼吸困難,高熱,血壓降低至 90/60 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa),考慮為急性過敏反應(yīng)引起,給予地塞米松治療后癥狀逐漸緩解。

    討 論

    肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率上升速度僅次于肺癌。原發(fā)性肝癌和繼發(fā)性肝癌手術(shù)切除率只為15﹪~30﹪,目前治療肝癌手段主要是手術(shù)、化療及放療,肝移植也是目前常用的方法,但供體有限,且僅限于早期肝癌。以上方法均難以長期改變患者的生存質(zhì)量。過繼免疫療法具有一定的抗腫瘤效果,免疫活性細(xì)胞在體內(nèi)能直接殺傷腫瘤細(xì)胞,且能調(diào)節(jié)和增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。因此,過繼免疫療法已成為腫瘤治療的輔助手段之一,為預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)、消除患者體內(nèi)殘留的腫瘤細(xì)胞和改善晚期腫瘤患者的生存質(zhì)量提供了新的治療途徑[4]。

    進(jìn)展期的惡性腫瘤誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生明顯的免疫耐受現(xiàn)象,患者自體淋巴細(xì)胞往往存在嚴(yán)重的免疫抑制[5],直接影響自體過繼性免疫治療的效果。但是,如果 CIK 細(xì)胞來源于異基因健康供者效果較好,因?yàn)榘胂嗪系牧馨图?xì)胞可以識(shí)別受者腫瘤抗原及其 MHCⅠ/Ⅱ類分子,所以異體免疫細(xì)胞具有較晚期腫瘤患者自體細(xì)胞強(qiáng)得多的抗腫瘤活性。其中,供者的 T 細(xì)胞是誘導(dǎo)疾病緩解的最重要的免疫細(xì)胞[6-11]。

    韓穎等[12]曾報(bào)道 HLA 半相合供者外周血活化干細(xì)胞治療晚期實(shí)體瘤 42例,取得了很好的效果,存在的問題是 GVL 效應(yīng)需要移植術(shù)后4~6個(gè)月才會(huì)發(fā)生,存在一定的局限性。本研究通過 HLA 配型確定供受者半相合后,采集健康供者外周血單個(gè)核細(xì)胞送實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng) CIK 細(xì)胞,再分 3次回輸,一方面可以保留異基因 CIK 細(xì)胞抗腫瘤的強(qiáng)大活力,另一方面,大量的活化免疫細(xì)胞直接進(jìn)入患者體內(nèi)可以直接殺傷腫瘤細(xì)胞,從而為晚期肝癌患者爭取寶貴的治療時(shí)間,同時(shí)副反應(yīng)與傳統(tǒng)的自體 CIK 細(xì)胞也無明顯差別。2例患者均可耐受,未出現(xiàn)大的副作用及并發(fā)癥,患者治療后AFP,臨床癥狀比治療前有明顯改善,卡氏評(píng)分有顯著提高,治療效果較明顯。晚期肝癌患者耐受力差,已經(jīng)失去了手術(shù)機(jī)會(huì),對(duì)于化療也可能因?yàn)樯眢w原因無法耐受。但細(xì)胞治療反應(yīng)溫和,安全有效,可改善患者臨床癥狀,提高生活治療。但目前病例數(shù)較少,在未來的研究中將增加更多病例以論證其可行性。。

    1 Wang F S,Liu M X,Zhang B,et al.Antitumor activites of human autologous cytokine - induced killer (CIK) cells against hepatocellular carcinoma cells in vitro and in vivo[J].World J Gastroenterol,2002,8(3):464- 468.

    2 Kaneko T,Fusauch Y,Kakui Ye,et al.Cytotoxicity of cytokine induced killer cells coated with bispecific antibodya gainst acute myeloid leukemia cells[J].Leukemia & Lymphoma,1994,14(3-4):219-229.

    3 杜清友,劉明旭,王福生,等.CIK細(xì)胞體內(nèi)外抗肝癌細(xì)胞作用[J].中國癌癥雜志,2001,11(4):325-327、330.

    4 Hoffman DM,Gitlitz BJ,Belldegrun A,et al.Adoptive cellular therapy[J].Semin Oncol,2000,27(2):221- 233.

    5 Ruggeri L,Mancusi A,2 Burchielli E,et al.NK cell alloreactivity and allogeneic hematopoietic stem cell transplantation[J].Blood CellsMol Di s,2008,40 (1):84-90

    6 Mavoungou E,Sall A,Poaty-Mavoungou V,et al.Alloreactivity and association of human natural killer cells with the major his to compatibility complex[J].Clin Diagn Lab Immunolo,1999,6(2):254-259.

    7 Van der Harst D,Goulmy E,Falkenburg JH,et al.Recognition ofminor histo-compatibility antigens on lymphocytic and myeloid leukemic cells by cytotoxic T-cell clones[J].Blood,1994,83(4):1060-1066.

    8 Appelbaum FR.Haematopoietic cell transplantation as immuno therapy[J].Nature,2001,411(2):385-389.

    9 Truitt RL,Atasoylu AA.Contribution of CD4+and CD8+T cells to graft-versus-host disease and graft-versusleukemia reactivity after transplantation of MHC compatible bone marrow[J].Bone Marrow Transplant,1991,8(1):51-58.

    10 Lewalle P,Hensel N,Guimaraes A,et al.Helper and cytotoxic lymphocyte responses to chronic myeloid leukemia:implications for adoptive immunotherapy with T cells[J].Br J Haematol,1996,92(3):587-594.

    11 Faber LM,van Luxemburg Heijs SA,Rijnbeek M,et al.Generation of leukemia reactive cytotoxic T lymphocyte clones from the HLA identical bonemar-donor of a patient with leukemia[J].J Exp Med,1996,176(5):1283-1289.

    12 韓穎,于津浦,李慧,等.HLA半相合外周血活化干細(xì)胞治療晚期實(shí)體瘤的療效[J].中國腫瘤生物治療雜志,2010,17(1):7-12.

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