供體胰腺保存方法的改進

董維平 蔡錦全 譚建明 王煜非 王鑒波 彭永德

糖尿病是嚴(yán)重危害人類健康的三大主要疾病之一，外源性胰島素替代療法雖能延緩糖尿病的發(fā)展，延長患者的生存期，但不能阻止糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展，胰島細(xì)胞移植是一種替代胰腺內(nèi)分泌功能的生理途徑[1]。目前胰島分離技術(shù)尚不成熟，往往需要2個或以上同血型的胰腺才能分離出1次移植所需要的胰島數(shù)量[2]，因而造成供體胰腺的嚴(yán)重緊缺。目前的供胰來源常為多器官捐獻者，在摘取其他器官時難免會傷及胰腺，由于胰腺組織一旦破損，受損的腺泡細(xì)胞會釋放胰蛋白酶原及其他消化酶原，對胰島有明顯的破壞作用，這更加劇了供體不足的矛盾。因此，我們嘗試在胰腺保存液中添加胰蛋白酶抑制劑，預(yù)防胰蛋白酶對胰島的破壞作用，使破損的胰腺也能用于分離胰島，從而擴大供胰的來源，提高供體胰腺的質(zhì)量。

材料與方法

一、材料

（一）胰腺來源

經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)、自愿捐獻的成人尸體胰腺。

（二）試劑

組織分散酶(Liberase HI,瑞士Roche公司)，胰蛋白酶抑制劑(烏司他丁,瑞士Roche公司)，威斯康辛大學(xué)保存液(UW液,美國Bristol-Myers Squibb公司)，全氟萘烷(PFC,美國FluoroMed公司)，雙硫腙（DTZ,Sigma公司)，丫啶橙(AO，Sigma公司)，碘丙啶(PI,Sigma公司)，胰島素檢測ELISA試劑盒（DSL公司）。

二、方法

（一）供胰摘取及運送

采用腹部大十字切口，開腹后先從腹主動脈下段插入雙腔氣囊導(dǎo)尿管，插至腹腔動脈上方充氣阻斷胸主動脈，4℃離體腎保存液( HC-A液)灌注，然后從腸系膜上靜脈插管，4℃ HC-A液灌注。開始灌注后迅速從下腔靜脈放血，并剪開胸腔阻斷肝上下腔靜脈。HC-A 液快速灌注排去肝、胰、腎和十二指腸內(nèi)血液后改為4℃UW 液灌注，同時用無菌鹽水碎冰塊置于腹腔內(nèi)加速降溫。灌注UW液后迅速將肝、脾、十二指腸和雙腎整塊切取。胰腺摘取后置4℃UW/PFC雙層保養(yǎng)液，于冰浴中保存運輸。根據(jù)胰腺的情況，分為：對照組（連十二指腸一起摘?。?、完整組（原位分離十二指腸和結(jié)扎胰管后摘取）和破損組（切除部分胰頭組織后摘取胰腺）。完整組與破損組的UW保養(yǎng)液中添加烏司他丁。

（二）胰腺鑒定

取出胰腺后，取保存胰腺的UW液檢測淀粉酶濃度，以檢驗胰腺受損程度。

（三）胰島分離純化、計數(shù)及活率鑒定

胰島細(xì)胞的分離純化按我們以前報道的方法進行[3]，純化后用含1﹪（V / V ）人血清白蛋白的RPMI 1640離心洗滌2次，取樣DTZ染色后進行胰島計數(shù)，并按公式換算為相當(dāng)于直徑150 μm的胰島當(dāng)量（islets equivalent quantity,IEQ） ；AO / PI雙色熒光染色，鑒定胰島的活率[4]。

（四）胰島功能檢測

純化、洗滌后的胰島用含1﹪人血清白蛋白的1066培養(yǎng)液，37℃，95﹪空氣，5﹪CO2培養(yǎng)過夜，收集后用無糖1640培養(yǎng)液洗2次，均分于3支離心管中，離心半徑17cm，1000 r/min離心1min后棄上清，加含1﹪人血清白蛋白的低糖1640培養(yǎng)液（2.8mmol/L葡萄糖），37℃培養(yǎng)2h，換1﹪人血清白蛋白的高糖1640培養(yǎng)液（含16.7mmol/L葡萄糖），37℃培養(yǎng)2h，收集培養(yǎng)液測胰島素含量，計算釋放指數(shù)（高糖胰島素含量/低糖胰島素含量），取3管的均數(shù)。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 10.5進行統(tǒng)計學(xué)處理，淀粉酶含量和胰島消化分離結(jié)果指標(biāo)及胰島功能和活力指標(biāo)以表示，著性檢驗采用完全隨機的F 檢驗，P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、烏司他丁對胰腺的保護作用

保存胰腺的UW液中淀粉酶的含量各組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。

二、胰島得率、純度和活率

胰腺經(jīng)Liberase HI消化分離，胰島純化后，各組的胰島得率、純度和活率的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。

三、胰島功能和活力檢測

各組的低糖、高糖胰島素含量和釋放指數(shù)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(表2)。

表1 各組淀粉酶含量和胰島消化分離結(jié)果的比較( )

表1 各組淀粉酶含量和胰島消化分離結(jié)果的比較( )

組別 例數(shù) 淀粉酶含量（U） 胰島得率( IEQ / 胰腺 ) 胰島純度(﹪) 胰島活率(﹪)對照組 12 31±21 319921±98496 66.9±27.7 95.8±1.14完整組 8 37±22 327095±121698 69.7±22.8 95.8±1.04破損組 6 44±16 295104±76505 68.5±20.8 95.8±1.17 F 值 0.835 0.182 0.031 0.000 P 值 0.446 0.835 0.969 0.954

表2 各組胰島功能和活力比較( )

表2 各組胰島功能和活力比較( )

組別 例數(shù) 胰島素含量( pmol/100 IEQ ) 釋放指數(shù)低糖 高糖對照組 12 149±66 387±186 2.98±1.70完整組 8 140±54 389±130 3.10±1.40破損組 6 137±31 394±128 2.85±0.48 F 值 0.112 0.013 0.053 P 值 0.894 0.987 0.948

討 論

消化液的充分灌注是胰島分離成功的一個關(guān)鍵因素[5]。因此，必須保證灌注前胰腺的完整。最近的證據(jù)已經(jīng)證實，胰島得率的不一致，與尸體胰內(nèi)生酶的激活有關(guān)[6]，大量研究證明內(nèi)生胰酶的釋放對胰島起傷害作用[7-11]。Krause等[12]的實驗亦證明胰蛋白酶有損壞胰島膜的作用，由于胰島散在分布于胰腺的腺泡實質(zhì)中，僅占整個胰腺的1﹪～2﹪，在分離和摘取胰腺過程中，如果傷及胰腺就會引起腺泡細(xì)胞的破壞，胰蛋白酶原及其它消化酶原自破壞的腺泡細(xì)胞中釋放出來。胰蛋白酶原具有激活自身的能力，使胰蛋白酶原轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘囊鹊鞍酌?，胰蛋白酶又可以迅速地激活其它的胰蛋白酶原和其他的許多酶原，引起一系列酶促反應(yīng)的“爆發(fā)”。胰蛋白酶除直接對胰島組織有破壞作用外，還可以激活磷脂酶A2，將卵磷脂和腦磷脂轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂泻軓姷募?xì)胞毒作用的溶血卵磷脂和溶血腦磷脂，使細(xì)胞和組織發(fā)生壞死。因此，為了保持胰腺的完整和防止因腺泡細(xì)胞破壞導(dǎo)致的內(nèi)生胰酶釋放，目前進行胰島分離的胰腺都采用帶十二指腸摘取。由于供體胰腺大多來源于多器官供體的尸體，帶十二指腸取胰必須剪斷腸管，極易造成供體器官的污染。在分離和摘取其它器官時，也難免碰傷胰腺組織，造成供體器官的浪費。如果在胰島的分離前加入胰蛋白酶抑制劑，防止受損胰腺胰蛋白酶和磷脂酶被過早過量激活，可大大提高胰腺的質(zhì)量和利用率。由于添加了胰蛋白酶抑制劑，保存液中檢測胰蛋白酶濃度的意義不大。因此，我們用保存液中的淀粉酶濃度來比較各組胰腺的受損程度。

烏司他丁主要通過與胰蛋白酶分子結(jié)合后使胰蛋白酶失活，從而抑制已激活的胰蛋白酶的活性，并進而避免大量胰蛋白酶原及其他一些消化酶原被過早激活；該藥還能同時獨立抑制胰蛋白酶、糜蛋白酶、透明質(zhì)酸酶、纖溶酶、彈性蛋白酶和羧基肽酶等多種酶的活性，并具有穩(wěn)定溶酶體膜的功能，從而抑制溶酶體酶的釋放，這是防止胰島組織被裂解破壞的重要保護措施之一。在UW-PFC雙層保存方法（two-layer method,TLM）的基礎(chǔ)上，在UW液中添加烏司他丁抑制胰蛋白酶的活性，用以保存破損的胰腺。對照組和破損組的各項指標(biāo)對比，結(jié)果對照組、完整組和破損組的UW液中淀粉酶含量的差異比較均沒有統(tǒng)計學(xué)意義；胰腺消化分離的胰島得率、純度和功能與對照組比較亦無統(tǒng)計學(xué)意義的差異。表明烏司他丁能有效的抑制受損胰腺釋放出的胰蛋白酶，對供體胰腺起到了保護的作用（表1）。

本組資料應(yīng)用烏司他丁的完整組、破損組與對照組比較，胰島素釋放試驗的低糖、高糖和釋放指數(shù)的差異都沒有統(tǒng)計學(xué)意義，表明烏司他丁對胰島的功能沒有影響。在目前的研究中Pefabloc [4- (2-氨基乙烷)氟氫氯酸苯] 、STI (大豆胰蛋白酶抑制劑) 等具有抑制胰蛋白酶功能的制劑被應(yīng)用于胰島提取中。但Lu等[13]研究數(shù)據(jù)顯示，STI對新鮮或經(jīng)低溫保存的大鼠胰腺的胰島得率沒有影響。Pefabloc 被認(rèn)為是一種有效的絲氨酸蛋白酶抑制劑，可以減弱胰蛋白酶的活性，保護胰島細(xì)胞[7,14]。Matsumoto等[15]在雙層保存液中添加 Pefabloc后，延長了胰腺的保存時間和改進了胰島活力的恢復(fù)。但 Pefabloc 是一種不可逆性的胰蛋白酶抑制劑，至今仍只在實驗研究中應(yīng)用，目前還沒有實驗證明可用于臨床。烏司他丁作為一種成品藥已應(yīng)用于臨床，因此有理由相信此方法為一種更為有效的胰腺保存方法。

本組資料結(jié)果表明，烏司他丁能有效的抑制低溫保存的成人胰腺內(nèi)生酶的激活，且對胰島的功能沒有影響。Goto等[16]應(yīng)用顏料溶液（Metyltioninklorid）和組織膠水（Indermil）檢測和修補漏洞，使破損胰腺也能用于分離胰島。如果在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用我們改進的胰腺保存方法，將大大提高供體胰腺的利用率。因此，在雙層保存液中添加烏司他丁：（1）使受損胰腺也能用于分離胰島，增加了供胰的來源；（2）可分離十二指腸后取胰，減少供體器官被污染的機會；（3）作為已在臨床使用的蛋白酶抑制劑，比Pefabloc更適用于供體胰腺的保存。

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