超選擇性股動(dòng)脈內(nèi)骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植治療股骨頭壞死187例

王紅梅 楊曉鳳 張軼斌 許憶峰 呂欣 呂乃武 劉福慶 賈銳周金旭 劉心平

股骨頭壞死是一類由于多種原因引起股骨頭區(qū)血液供應(yīng)障礙，進(jìn)而使骨組織發(fā)生缺血、變性、壞死、骨小梁斷裂及股骨頭塌陷，最終導(dǎo)致髖關(guān)節(jié)功能障礙的疾病，治療本病的關(guān)鍵是如何改善股骨頭區(qū)的血液供應(yīng)，以進(jìn)一步修復(fù)骨質(zhì)。近年來發(fā)現(xiàn)由于缺血引起的損傷可通過側(cè)支循環(huán)的建立（arteriogenesis）和血管的新生（angiogenesis）得到代償[1]，自體干細(xì)胞移植血管再生技術(shù)的基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用為股骨頭壞死的治療提供了新的思路。本研究對(duì)2004年7月至2010年11月的187例股骨頭壞死患者進(jìn)行了經(jīng)股動(dòng)脈內(nèi)超選擇性自體骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植的臨床研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

資料與方法

一、臨床資料

（一）一般情況

2004年7月至2010年11月期間187例股骨頭壞死住院患者，男性126例，女性61例，年齡11～68歲，病程3～96（23.5±6.0）個(gè)月，均有髖關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)疼痛，其中146例跛行，138例髖關(guān)節(jié)功能障礙。經(jīng)髖關(guān)節(jié) X 線攝片確診101例，經(jīng) CT 確診 44例，經(jīng) MRI 確診 42例。單側(cè)股骨頭壞死 122例，雙側(cè)股骨頭壞死65例，共252髖。187例患者均接受過中藥、按摩和理療等治療，病情均未獲得緩解或繼續(xù)惡化，其中采用介入溶栓治療的患者46例，植骨手術(shù)31例。所有患者均簽訂知情同意書，并經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)討論批準(zhǔn)。

（二）分期標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)世界骨循環(huán)研究學(xué)會(huì)（ARCO）的國際骨壞死標(biāo)準(zhǔn)[2]對(duì)187例患者進(jìn)行分期：Ⅰ期39 髖，Ⅱ 期 97 髖，Ⅲ 期 88 髖，Ⅳ 期 28 髖。

（三）主要試劑和儀器

Ficoll分離液購自上海華精生物高科技有限公司，F(xiàn)ACS Caliber 流式細(xì)胞儀為美國 BD 公司。

二、方法

（一）股骨頭供血?jiǎng)用}造影

將自體骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植入患者體內(nèi)前，全部患者均采用數(shù)字減影血管造影技術(shù)（digital subtraction angiography,DSA）觀察股骨頭動(dòng)脈供血情況。

（二）骨髓單個(gè)核細(xì)胞制備和檢測

一方面，組織自身具體操作化為組織成立背景、組織定位、組織結(jié)構(gòu)、組織資源四個(gè)方面。本研究舉例了組織成立的四種不同背景，即香港背景、高校背景、民間背景以及混合背景（香港+高校），研究發(fā)現(xiàn)不同背景的社工組織對(duì)組織自身存在和日后發(fā)展的定位存在著很大差異，同時(shí)在組織內(nèi)部人員分工和構(gòu)成、所能夠掌握和獲得的內(nèi)外部資源都有很大不同。這里需要說明的是，并非某一特定組織背景一定搭配某種組織定位、結(jié)構(gòu)和資源，在現(xiàn)實(shí)情況中往往要復(fù)雜得多。

選擇患者雙側(cè)髂后上棘，嚴(yán)格無菌操作，2﹪?yán)嗫ㄒ蚓植柯樽砗?，緩慢抽取骨?00～360ml，F(xiàn)icoll 密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測 CD34+細(xì)胞和CD133+細(xì)胞在所分離出的干細(xì)胞懸液中的含量，將單個(gè)核細(xì)胞用生理鹽水制備成細(xì)胞懸液20～30ml待用。

（三）自體骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植

設(shè)自身前后對(duì)照。將導(dǎo)管超選擇性送入患側(cè)旋股內(nèi)動(dòng)脈、旋股外動(dòng)脈和閉孔動(dòng)脈，取自體骨髓單個(gè)核細(xì)胞懸液20～30ml緩慢灌注入患側(cè)動(dòng)脈內(nèi)。移植的單個(gè)核細(xì)胞總數(shù)為（2.4～7.8）×108個(gè)，CD34+細(xì)胞和CD133+細(xì)胞平均含量分別為2.47﹪±0.58﹪ 和1.29﹪±0.35﹪。

（四）髖關(guān)節(jié)疼痛程度觀察與髖關(guān)節(jié)功能評(píng)價(jià)

骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植術(shù)后第3、6、12、24、48個(gè)月觀察髖關(guān)節(jié)疼痛程度和應(yīng)用髖關(guān)節(jié) Harris 評(píng)分進(jìn)行療效評(píng)價(jià)，HHS > 90 分為優(yōu)，75～90 分為良，60～74.9 分為可，< 60 分為差。

（五）股骨頭供血?jiǎng)用}觀察與髖關(guān)節(jié)影像學(xué)檢查

骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植術(shù)后 6 個(gè)月行股骨頭供血?jiǎng)用} DSA 觀察，為保證造影結(jié)果的可信性，采用移植術(shù)前同一設(shè)備和相同造影條件觀察患者血管新生及股骨頭供血?jiǎng)用}充盈情況，移植術(shù)后12、24、36和48個(gè)月行髖關(guān)節(jié) X 線攝片、 CT和MRI 檢查，觀察股骨頭區(qū)的形態(tài)學(xué)變化。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用 SPSS 12.0 軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，臨床癥狀改善指標(biāo)用相對(duì)數(shù)表示，不同檢查方法改善情況比較用卡方檢驗(yàn)；移植前后髖關(guān)節(jié)Harris評(píng)分以表示，組間差異用單因素方差分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、股骨頭供血?jiǎng)用}的觀察

移植術(shù)前217 髖旋股內(nèi)、旋股外及閉孔動(dòng)脈均有不同程度的狹窄或閉塞，僅有12 髖可見側(cè)支循環(huán)建立，35 髖血管基本正常。

二、髖關(guān)節(jié)疼痛程度與髖關(guān)節(jié)功能

患者隨訪3～48（24.2±4.5）個(gè)月，其中髖關(guān)節(jié)疼痛緩解者 158例（84.5﹪），髖關(guān)節(jié)功能改善者 146例（78.1﹪），行走間距延長（自身前后對(duì)照）者 149例（79.7﹪，表1）。

表1 干細(xì)胞移植術(shù)后不同時(shí)間臨床癥狀改善情況

骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植術(shù)后3、6、12和24個(gè)月對(duì)患者進(jìn)行髖關(guān)節(jié) Harris 評(píng)分顯示，與移植術(shù)前（對(duì)照組）組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植時(shí)間越長，分?jǐn)?shù)值越高，優(yōu)良率顯著增加（表 2）。

表2 ANFH 干細(xì)胞移植術(shù)前后髖關(guān)節(jié) Harris 評(píng)分結(jié)果( )

表2 ANFH 干細(xì)胞移植術(shù)前后髖關(guān)節(jié) Harris 評(píng)分結(jié)果( )

注：a術(shù)后與術(shù)前 Harris 評(píng)分對(duì)照

評(píng)定時(shí)間 隨訪例數(shù) 疼痛(分) 關(guān)節(jié)功能（分） 總分術(shù)前 187 25.4±11 27±12 57±18術(shù)后 3個(gè)月 172 26.0±12 27±10 59±17術(shù)后 6個(gè)月 134 30.0±10 32±11 67±12術(shù)后12個(gè)月 126 33.0±12 34± 9 74± 8術(shù)后24個(gè)月 85 36.0± 8 38± 8 85±11 F 值 21.444 25.522 74.221 P 值 0.000 0.000 0.000

三、股骨頭供血?jiǎng)用}觀察與髖關(guān)節(jié)影像學(xué)

骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植術(shù)后 6 個(gè)月54例患者行DSA 股骨頭供血?jiǎng)用}檢查，48例顯示旋股內(nèi)動(dòng)脈、旋股外動(dòng)脈及閉孔動(dòng)脈管徑增粗，新生血管增多，原已閉塞的動(dòng)脈也重新開通，血流速度增快，局部血液循環(huán)明顯改善；與移植術(shù)前血管造影結(jié)果比較，股骨頭區(qū)血液供應(yīng)明顯改善，可見大量新生血管（ 圖 1）。

圖1 DSA 檢測移植術(shù)前后股骨頭供血?jiǎng)用}情況

骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植術(shù)后 12、24、36和48個(gè)月行髖關(guān)節(jié) X 線攝片、CT、MRI 檢查顯示，53例患者中 42例 MRI 發(fā)現(xiàn)低信號(hào)區(qū)所占股骨頭體積的百分比與術(shù)前比較顯著降低（表3），可見股骨頭區(qū)壞死的骨結(jié)構(gòu)好轉(zhuǎn)，囊性變區(qū)面積縮小，骨折線趨于愈合，股骨頭表面軟骨凹陷消失，髖關(guān)節(jié)面光滑（圖2）；髖關(guān)節(jié) CT 可見股骨頭有新骨形成，骨折線修復(fù)，髖關(guān)節(jié)軟骨炎癥明顯減輕或消失。由表3可以看出，通過移植術(shù)后不同時(shí)間觀察，MRI能夠更敏感地反映出髖關(guān)節(jié)病變程度，與 CT 和X 線比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。

圖2 MRI檢測移植術(shù)前后股骨頭區(qū)變化情況

表3 移植術(shù)后髖關(guān)節(jié)影像學(xué)檢查改善情況

討 論

股骨頭壞死是一種嚴(yán)重危害人類健康、致殘率極高的常見病。目前治療方法有多種，如體外震波療法、高壓氧療法、介入療法、中藥療法、各種骨移植術(shù)、血管移植術(shù)術(shù)、死骨清除骨材料填充術(shù)、髓芯減壓術(shù)及髖關(guān)節(jié)置換術(shù)等，均有一定療效，但無論哪一種方法對(duì)于本病的分期選擇存在較大的局限性，并且缺乏長期追蹤觀察研究。

目前干細(xì)胞技術(shù)逐漸興起和發(fā)展，使干細(xì)胞治療股骨頭壞死成為研究的熱點(diǎn)。干細(xì)胞具有多向分化潛能，在特定的環(huán)境中與細(xì)胞因子作用定向分化為其他細(xì)胞，促進(jìn)受損組織修復(fù)[3]。多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)及臨床研究已經(jīng)證實(shí)骨髓干細(xì)胞可以向骨組織及血管組織轉(zhuǎn)化。骨髓干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)后，在一定的誘導(dǎo)條件下，可以向成骨細(xì)胞方向分化[4-5]。

Gehling 和Quirici等[6-7]研究表明，在體外動(dòng)員外周血來源的CD133+細(xì)胞能誘導(dǎo)骨髓干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)缺血肢體血流修復(fù)。這種前體細(xì)胞具有高增殖分化潛能，以血管生成方式參與缺血性局部代償血管重建過程。骨髓干細(xì)胞動(dòng)脈灌注兔股骨頭壞死實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，骨髓干細(xì)胞可疏通發(fā)生病變的股骨頭內(nèi)血管，改善股骨頭壞死區(qū)及周圍組織血液循環(huán)，促進(jìn)血管再生[8]。1997年，Hernigou 等[9]首先應(yīng)用自體骨髓干細(xì)胞植入壞死區(qū)治療鐮狀細(xì)胞病患者的股骨頭壞死，取得良好療效。2002年，Hernigou 和Beaujean等[10]采用髓芯減壓術(shù)加自體骨髓細(xì)胞植入術(shù)治療189例早期股骨頭壞死患者，通過5～10年隨訪證實(shí)，髓芯減壓術(shù)加自體骨髓細(xì)胞植入術(shù)比單純髓芯減壓術(shù)更有利于骨壞死的修復(fù)。2004年，Gangji 等[11]報(bào)道了對(duì)18例 ARCO I～I(xiàn)I 期股骨頭壞死進(jìn)行了2 年半的前瞻性隊(duì)列研究，臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Hernigou 的臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同，并提示骨髓單個(gè)核細(xì)胞及間充質(zhì)干細(xì)胞可能對(duì)早期股骨頭壞死有修復(fù)和重塑作用。經(jīng)動(dòng)脈骨髓干細(xì)胞移植治療各種病因引起的股骨頭壞死已獲得顯著臨床療效[12-15]。

本研究所選187例股骨頭壞死患者在接受骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植術(shù)前均應(yīng)用多種方法治療未見明顯療效，其主要原因是股骨頭區(qū)缺血狀態(tài)未獲改善。將骨髓單個(gè)核細(xì)胞超選擇性移植到股骨頭區(qū)狹窄或閉塞的動(dòng)脈內(nèi)使其向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化，多條新生血管使股骨頭區(qū)供血得到改善。根據(jù)本研究結(jié)果推測，骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植治療股骨頭壞死的機(jī)制可能為單個(gè)核細(xì)胞在缺氧環(huán)境下分泌多種細(xì)胞因子，形成新生血管網(wǎng)絡(luò)，促進(jìn)骨細(xì)胞生長，使股骨頭發(fā)生組織學(xué)修復(fù)。本組患者隨著移植時(shí)間延長，臨床癥狀改善愈加明顯，一般在移植術(shù)后12～24個(gè)月癥狀改善最佳，移植術(shù)前后髖關(guān)節(jié)功能改善非常顯著。

本項(xiàng)臨床研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)動(dòng)脈內(nèi)單個(gè)核細(xì)胞移植治療股骨頭壞死主要適合國際分期 Ⅰ～Ⅲ期初的早中期病變患者，如股骨頭已發(fā)生明顯塌陷、髖關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)改變的 Ⅲ 期末、Ⅳ 期患者效果不佳。超選擇性動(dòng)脈內(nèi)單個(gè)核細(xì)胞移植與直接進(jìn)行股骨頭局部干細(xì)胞移植比較，具有細(xì)胞存活分化環(huán)境優(yōu)良、手術(shù)微創(chuàng)、無二次損傷、適應(yīng)證寬泛、操作簡單安全及患者依從性好等特點(diǎn)。在治療中未發(fā)生嚴(yán)重不良反應(yīng)事件，說明該方法具有較好的安全性。本技術(shù)尚有一些問題需要解決，如細(xì)胞移植的最佳時(shí)機(jī)，新生血管的再狹窄預(yù)防、壞死骨組織修復(fù)的時(shí)間和程度等，均有待進(jìn)一步研究。

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