表達(dá)譜芯片分析PPAR-α調(diào)控脂肪代謝過程作用機(jī)理的研究

侯曉亮，畢重朋

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所，哈爾濱 150030；2.黑龍江民族職業(yè)學(xué)院，哈爾濱 150081）

哺乳動物的脂肪代謝為三大物質(zhì)代謝之一，其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑具有復(fù)雜而精細(xì)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，主要參與了機(jī)體的能量供應(yīng)及儲存、生物膜的構(gòu)成及其他一些重要的生命過程。脂肪代謝主要包括甘油三酯（TG）代謝、膽固醇及其酯的代謝、磷脂和糖脂代謝等。

在這些代謝過程中，大量的蛋白酶、受體、轉(zhuǎn)錄因子等參與其中，又受一些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)控，形成了復(fù)雜而精細(xì)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以維持細(xì)胞乃至整個機(jī)體的脂代謝平衡。小腸對于飼料養(yǎng)分的選擇性吸收往往是被一些運(yùn)輸?shù)鞍缀痛x酶類所介導(dǎo)的，這些物質(zhì)被統(tǒng)稱為“腸道屏障蛋白”。其中，過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPAR－α）是一種在基因表達(dá)水平上調(diào)節(jié)脂肪代謝作用的重要受體，且大量富集于腸內(nèi)表達(dá)。

基因芯片技術(shù)是20世紀(jì)90年代以來生命科學(xué)領(lǐng)域中的重大科技進(jìn)步之一，是集分子生物學(xué)、化學(xué)、微電子學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)和生物信息學(xué)等諸多學(xué)科為一體的高新技術(shù)。近年來基因芯片技術(shù)不斷得到完善，并在發(fā)病機(jī)理、診斷治療、藥物篩選與研發(fā)、染色體缺陷等諸多領(lǐng)域顯示出了巨大的應(yīng)用價(jià)值。在動物體的研究中，主要通過對小鼠、大鼠和畜禽等試驗(yàn)來探索基因功能、新藥篩選、疾病的臨床診斷和檢測等。隨著基因芯片技術(shù)的廣泛應(yīng)用以及相關(guān)芯片實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)在公共數(shù)據(jù)庫中的公布，為從基因組層面上研究轉(zhuǎn)錄因子PPAR－α調(diào)控脂肪代謝過程機(jī)理提供了理論參考。

1 試驗(yàn)材料

從NCBI中的GEO數(shù)據(jù)庫搜索并獲得與小鼠脂肪代謝相關(guān)的基因芯片數(shù)據(jù)，序列號為GSE9533，芯片平臺為Affymetrix公司的小鼠全基因組Mouse 430_2芯片[1]。該系列芯片總樣本數(shù)為35個，從中選取與轉(zhuǎn)錄因子PPAR－α的激活劑WY14643相關(guān)的后8個樣本數(shù)據(jù)，包括野生型樣本4個（樣本號分別為GSM241420～GSM241423），PPAR－α 敲出型樣本4個（樣本號分別為GSM241424～GSM241427）。該芯片為分別選取純種的野生型（129S1/SvIm J）和PPAR－α敲出型（129S4/SvJae）小鼠作為試驗(yàn)對象，并在其飼料中添加WY14643，飼養(yǎng)6 h后，分別取各組中4只小鼠小腸組織的RNA樣本，用MOE 430v2.0GeneChip?陣列標(biāo)記。

2 試驗(yàn)方法

2.1 顯著性差異表達(dá)

研究PPAR－α的缺失對小鼠基因組結(jié)構(gòu)的改變情況，對該芯片的顯著性差異表達(dá)基因進(jìn)行分析。運(yùn)用RobustMultichip Averaging（RMA）算法對所選取的8個樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行背景校正和標(biāo)準(zhǔn)化操作[2]；針對Case－Control的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，利用非配對t檢驗(yàn)方法比對處理組與對照組樣本基因表達(dá)量，篩選與PPAR－α轉(zhuǎn)錄因子存在著顯著性相關(guān)的基因，其中將顯著性水平閾值設(shè)為0.05（P=0.05），倍數(shù)改變值（Fold Change）設(shè)定為2。上述操作均在R程序結(jié)合Bioconductor軟件包的環(huán)境下實(shí)現(xiàn)的[3]。

2.2 聚類分析和通路分析

運(yùn)用2×3的自組織聚類法（SOM）對上述差異表達(dá)基因進(jìn)行聚類分析；為了確定所篩選出來的顯著性差異表達(dá)基因所參與的通路，采用費(fèi)舍爾精確性檢驗(yàn)（Fisher exact test）原理并結(jié)合KEGG數(shù)據(jù)庫及DAVID網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫工具對差顯基因進(jìn)行功能注釋和通路分析[4－5]。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 顯著性差異表達(dá)基因分析

通過顯著性差異表達(dá)分析，利用各基因的P值和倍數(shù)改變量得到顯著性差異表達(dá)基因數(shù)為158個，其中上調(diào)的基因有7個，下調(diào)的基因有151個。即表明與PPAR－α的缺失存在顯著性正相關(guān)的基因有7個，負(fù)相關(guān)的基因有151個。

3.2 聚類分析

通過對非配對t檢驗(yàn)方法所得到的158個顯著性差異表達(dá)基因的聚類分析，可以得到6種聚類。其中，第一聚類包含23個基因，表達(dá)量值取以2為底的對數(shù)變化范圍從－1到2；第二聚類包含20個基因，表達(dá)量值取以2為底的對數(shù)變化范圍從－3到2；第三聚類包含38個基因，表達(dá)量值取以2為底的對數(shù)變化范圍從－2.5到2.5；第四聚類包含35個基因，表達(dá)量值取以2為底的對數(shù)變化范圍從－2到2；第五聚類包含21個基因，表達(dá)量值取以2為底的對數(shù)變化范圍從－3到2.5；第六聚類包含21個基因，表達(dá)量值取以2為底的對數(shù)變化范圍從－4到4.5。

3.3 通路分析

設(shè)定顯著性水平閾值為0.01，得到與PPAR－α顯著性相關(guān)的通路有10個，見附表。

附表 與PPAR-α顯著性相關(guān)通路列表

如附表所示，與PPAR－α顯著性相關(guān)的通路包括最顯著的為脂肪酸代謝通路，顯著性水平為1.85E－17，包含14個差異顯著性基因；其次，依次包含PPAR信號通路、不飽和脂肪酸生物合成、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解、丙酮酸代謝、視黃醇代謝、脂肪細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、乙酯代謝、泛酸和輔酶A生物合成以及檸檬烯和蒎烯降解這9個通路。

4 討論

哺乳動物的小腸是消化和吸收飼料以及營養(yǎng)物質(zhì)的主要場所。小腸上皮組織對這些營養(yǎng)物質(zhì)分子的吸收主要是通過多個跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體來實(shí)現(xiàn)，主要包含溶質(zhì)載體和ATP結(jié)合盒這兩個轉(zhuǎn)運(yùn)超家族[6－7]。很多研究表明，營養(yǎng)物質(zhì)影響基因表達(dá)作用主要是通過激活或者抑制特定的轉(zhuǎn)錄因子來實(shí)現(xiàn)的[8－9]。其中，過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARs）是一類重要的受體，其能夠在基因表達(dá)水平上調(diào)節(jié)膳食中脂肪酸及其衍生物代謝作用[10]。同時，PPAR s含三個亞型即α、β和γ，各自具有不同的特點(diǎn)以及生物學(xué)功能。PPAR－α已經(jīng)被證實(shí)在小腸中表達(dá)量較高[11－12]。然而，目前對于PPAR－α在小腸中調(diào)節(jié)脂肪代謝的分子遺傳學(xué)機(jī)制的研究報(bào)道較少。

本研究基于表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明，PPAR－α在小鼠小腸組織細(xì)胞中調(diào)控脂肪代謝過程是通過一系列的相關(guān)通路及其關(guān)鍵基因起作用的。脂肪細(xì)胞分化與糖和脂肪代謝、機(jī)體能量平衡、肥胖、Ⅱ型糖尿病、脂肪肝、高血脂及乳腺癌等有著十分密切的關(guān)系。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，對脂肪細(xì)胞分化機(jī)制及其調(diào)控的研究對于了解、預(yù)防和治療這些重大疾病具有重大的理論和現(xiàn)實(shí)意義。在動物科學(xué)領(lǐng)域，研究動物脂肪細(xì)胞分化的調(diào)控機(jī)理，結(jié)合脂肪代謝調(diào)控的研究成果，增加脂肪在肌肉內(nèi)的沉積，減少皮下和內(nèi)臟的脂肪積累，以實(shí)現(xiàn)對動物脂肪沉積的調(diào)控，從而改善肉品品質(zhì)。

目前，PPAR－α作為脂肪代謝過程中重要的轉(zhuǎn)錄因子已成為研究的熱點(diǎn)[13]。本文通過對在小鼠小腸中與轉(zhuǎn)錄因子PPAR－α相關(guān)芯片的分析，得到了在脂肪酸代謝過程中與PPAR－α相關(guān)的靶基因Gyk、Hmgcr等，并獲得了在PPAR－α調(diào)控脂肪代謝過程中顯著性參與的一些通路，如PPAR信號通路和脂肪酸代謝通路等。這些都有助于從基因組層面上更好地了解PPAR－α調(diào)控小腸脂肪代謝過程作用的機(jī)理，從而為實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)提供了重要的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

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