口蹄疫滅活疫苗的發(fā)展

張龍，李培林，任偉，謝文強(qiáng)，郭建軍，宋振文，賈英，謝雪岑，李春燕，劉艷霞

（金宇保靈生物藥品有限公司,內(nèi)蒙古呼和浩特 010030）

一、概述

口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的牛、羊、豬等家畜發(fā)病的急性傳染病，由于其傳播快，不僅給畜牧業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且嚴(yán)重影響國際貿(mào)易，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織將其列為必須上報(bào)的疫病之一。FMD血清型眾多，包 括 O、A、Asia1、SAT1、SAT2和SAT 3型共7個(gè)血清型，血清型間無交叉保護(hù)，控制難度較大。2003年歐盟修訂了FMD防控策略，肯定了疫苗免疫在FMD爆發(fā)時(shí)的作用，隨后歐盟多個(gè)國家將疫苗免疫作為補(bǔ)充手段用于FMD的控制。滅活疫苗在歐美等地的FMD防制和根除中發(fā)揮了重要的作用，直到今天，滅活疫苗仍然是成功防控FMD的重要措施，經(jīng)過幾十年的發(fā)展，F(xiàn)MD滅活疫苗在抗原生產(chǎn)、滅活、濃縮純化、乳化等方面不斷豐富和發(fā)展，在動(dòng)物疫苗生產(chǎn)中已形成具有示范性的工業(yè)化生產(chǎn)體系。

目前，世界上FMD滅活疫苗生產(chǎn)和應(yīng)用的主要有BEI滅活油佐劑疫苗和甲醛滅活鋁膠皂素疫苗，在滅活疫苗的質(zhì)量控制上，更注重于疫苗的生物安全和免疫效力兩個(gè)方面，因此，近些年來，F(xiàn)MD研究機(jī)構(gòu)和生產(chǎn)廠家將力量集中到抗原生產(chǎn)工藝、滅活劑選擇、濃縮純化、佐劑以及生產(chǎn)過程疫苗中效力的替代檢驗(yàn)等關(guān)鍵技術(shù)的研究。

二、FMD滅活疫苗歷史

縱觀FMD疫苗的研究和應(yīng)用歷史，F(xiàn)MD疫苗經(jīng)歷了滅活疫苗、活疫苗、滅活疫苗、新型疫苗這一歷史進(jìn)程。而滅活疫苗從最初的舌皮組織毒經(jīng)甲醛滅活制成的疫苗到后來的細(xì)胞培養(yǎng)病毒經(jīng)BEI滅活制成疫苗，經(jīng)歷了20年的時(shí)間。FMD病毒抗原生產(chǎn)方式主要有三種方式:牛舌皮組織生產(chǎn)的Frenkel培養(yǎng)方法；轉(zhuǎn)瓶BHK21細(xì)胞單層培養(yǎng)法；BHK21細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方法。轉(zhuǎn)瓶單層培養(yǎng)方法是勞動(dòng)密集型生產(chǎn)方式，生產(chǎn)過程生物安全較難控制，容易散毒,而懸浮培養(yǎng)法屬于技術(shù)密集型生產(chǎn)方式，制備病毒抗原快速便捷，能很好保證生產(chǎn)過程中的生物安全，是目前主要的生產(chǎn)方式。截止2011年年初,我國已有兩個(gè)國家指定口蹄疫疫苗企業(yè)采用了懸浮工藝生產(chǎn)口蹄疫疫苗。該工藝的推行勢必會(huì)給口蹄疫疫苗的生產(chǎn)工藝甚至動(dòng)物疫苗的生產(chǎn)工藝帶來巨大革新，也勢必會(huì)促進(jìn)我國獸用疫苗質(zhì)量的巨大提升。

1.組織舌皮毒。該方法制造的FMD滅活疫苗最早可追溯到上世紀(jì)20年代。1926年，法國科學(xué)家Vallee等發(fā)現(xiàn)FMD病毒經(jīng)甲醛滅活后，仍具有免疫原性，但工藝不好控制，滅活的病毒要么留有殘毒，要么失去了免疫原性。1939年，丹麥科學(xué)家Schmidt發(fā)現(xiàn)氫氧化鋁膠體具有無毒性和免疫刺激的功能。1937年，德國科學(xué)家Waldmann首次將病毒的滅活與乳化引入到FMD疫苗生產(chǎn)中來，獲得了符合實(shí)際應(yīng)用的FMD疫苗——鋁膠甲醛滅活疫苗。

1947年，F(xiàn)renkel等首次采用牛舌上皮細(xì)胞培養(yǎng)FMDV獲得成功，為抗原的大量生產(chǎn)提供了經(jīng)濟(jì)、穩(wěn)定的途徑，該疫苗在歐洲FMD防控中發(fā)揮了巨大的作用。但這種疫苗制苗材料來源不易,使生產(chǎn)和應(yīng)用受到限制。

2.單層細(xì)胞培養(yǎng)毒。Frenkel等培養(yǎng)系統(tǒng)建立以后，組織培養(yǎng)學(xué)快速發(fā)展，原代細(xì)胞培養(yǎng)體系也迅速建立起來，1960年，利用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)體系建立的牛腎細(xì)胞原代培養(yǎng)建立起來，緊接著，BHK21傳代細(xì)胞系得到了應(yīng)用，傳代細(xì)胞比原代細(xì)胞具有較多的優(yōu)點(diǎn)。上個(gè)世紀(jì)60年代，人們就開始采用轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)病毒，該工藝具有成熟度高，占地面積小，投資成本小等優(yōu)點(diǎn)，因此許多國家建立了規(guī)?；a(chǎn)工廠，截至到目前，我國仍然以該工藝為FMD疫苗主要生產(chǎn)方式。然而，該系統(tǒng)勞動(dòng)量大，由于生產(chǎn)過程中難以保證生物安全和疫苗質(zhì)量批次不穩(wěn)定等因素，在發(fā)達(dá)國家?guī)缀跻呀?jīng)停止應(yīng)用。1967年，人們利用微載體系統(tǒng)建立起了BHK21細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系，在實(shí)驗(yàn)室的體系得到了批量化的生產(chǎn)。盡管如此，微載體由于其成本和系統(tǒng)的復(fù)雜性在FMD疫苗的生產(chǎn)上沒有得到工業(yè)化應(yīng)用。

3.懸浮細(xì)胞培養(yǎng)毒。1962年，人們發(fā)現(xiàn)BHK21細(xì)胞能全懸浮培養(yǎng)，細(xì)胞在此體系中增值速度很快，在較短的時(shí)間便可以達(dá)到工業(yè)化量。1985年，這種體系被廣泛的用在FMD疫苗生產(chǎn)中。至今，世界上已經(jīng)有5 000 L的發(fā)酵罐在應(yīng)用。細(xì)胞在一定濃度的小牛血清和MEM培養(yǎng)基中，密度在2～3 d即可增加到5×106個(gè)/ml或更高。懸浮培養(yǎng)在FMD疫苗生產(chǎn)中處于核心地位。1965年，生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)最早用于口蹄疫疫苗生產(chǎn)，當(dāng)時(shí)的生物反應(yīng)器容積是30 L。1983年，英國Wellcome公司就已能夠利用5 000 L的細(xì)胞罐大規(guī)模生產(chǎn)口蹄疫疫苗。目前，商品化的生物反應(yīng)器已經(jīng)可以達(dá)到20 000 L，大大提高了生產(chǎn)效率和質(zhì)量，同時(shí)降低了生產(chǎn)成本。

懸浮系統(tǒng)的應(yīng)用，使無血清懸浮培養(yǎng)成為疫苗生產(chǎn)過程的主要工藝之一。通過用已知人源或動(dòng)物來源的蛋白或激素代替動(dòng)物血清進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，能減少后期純化工作，提高產(chǎn)品質(zhì)量，不僅能夠減少生產(chǎn)中污染幾率，而且還能避免血清中潛在的一些病原微生物影響細(xì)胞培養(yǎng)或者對(duì)疫苗使用者造成威脅，也便于在生物反應(yīng)器中進(jìn)行代謝流分析，實(shí)施在線過程監(jiān)控，精確投料。無血清產(chǎn)品更加符合國際GMP生產(chǎn)要求，對(duì)我國FMD疫苗走向國際市場具有重要意義。

三、FMD疫苗生產(chǎn)和使用中的關(guān)鍵要素

1.病毒種子。一般來說，一個(gè)好的疫苗毒株應(yīng)該選擇流行株，但是流行株不一定能夠作為疫苗毒株來使用，首先疫苗毒株必須適應(yīng)細(xì)胞，保持其毒力、抗原性穩(wěn)定，而且其抗原譜必須廣，能夠經(jīng)受大多數(shù)流行野毒的攻擊。必須滿足上述條件的流行毒株才可以作為疫苗候選毒株。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，基因序列分析在病毒流行病學(xué)研究上發(fā)揮了重要的作用，序列測定在評(píng)價(jià)疫苗株與流行毒株親緣關(guān)系方面具有重要的參考價(jià)值，然而這種方法對(duì)篩選疫苗候選毒株作用不大，在疫苗毒株的篩選中，應(yīng)更多的采用血清中和試驗(yàn)和阻斷ELISA方法，r值是評(píng)價(jià)疫苗株與流行毒株抗原關(guān)系的主要指標(biāo)。由于FMD容易發(fā)生變異，相關(guān)機(jī)構(gòu)應(yīng)定期分析本國或本地區(qū)疫苗株與流行毒株的抗原關(guān)系，以期選擇適合的疫苗去防控FMD。

選定的毒株必須在單層細(xì)胞或懸浮細(xì)胞上連續(xù)傳代，以期達(dá)到穩(wěn)定的生長狀態(tài)，病毒在不同種類和生長狀態(tài)的細(xì)胞上適應(yīng)力是不同的，一般來說，病毒在單層細(xì)胞上生長的狀態(tài)要明顯的好于懸浮細(xì)胞，這種結(jié)果可能與細(xì)胞的生長狀態(tài)有直接的關(guān)系，這就要求病毒在制作種子批的時(shí)候，應(yīng)事先在單層上傳代，待病毒表現(xiàn)出良好的生長狀態(tài)時(shí)再用傳代細(xì)胞生長。但同時(shí)，在疫苗制造過程中，傳代會(huì)導(dǎo)致毒株的變異，因此，應(yīng)盡量減少病毒的傳代次數(shù)。我國病毒的種子批分為原始種子批、基礎(chǔ)種子批和生產(chǎn)用種子批，基礎(chǔ)種子批毒種必須經(jīng)過嚴(yán)格的檢驗(yàn)，由基礎(chǔ)種子批到疫苗成品的毒種代次應(yīng)不超過5代。

2.細(xì)胞及用于細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基。適應(yīng)FMDV生長的細(xì)胞除常用的BHK21細(xì)胞，還有IBRS細(xì)胞。一般來說，盡管BHK細(xì)胞來源于同一種組織，但是根據(jù)其傳代歷史，不同的細(xì)胞株對(duì)病毒的適應(yīng)能力是不同的，有的細(xì)胞對(duì)病毒敏感，有的細(xì)胞不敏感。根據(jù)世界疫苗制造工藝的發(fā)展趨勢，能較好適應(yīng)懸浮培養(yǎng)，短時(shí)間內(nèi)大量增殖和支持病毒良好生長的懸浮細(xì)胞系是FMD工業(yè)化生產(chǎn)所必需的。在細(xì)胞培養(yǎng)中培養(yǎng)基的選擇優(yōu)化尤其是血清的類別對(duì)細(xì)胞的生長和病毒的敏感性尤為重要，需要具體技術(shù)人員不斷摸索、選擇和優(yōu)化。

四、疫苗生產(chǎn)關(guān)鍵過程控制

1.細(xì)胞及病毒培養(yǎng)。能夠很好的支持病毒生產(chǎn)和穩(wěn)定傳代的細(xì)胞是疫苗生產(chǎn)的關(guān)鍵步驟之一，在現(xiàn)代FMD疫苗生產(chǎn)過程中，一般采用BHK21細(xì)胞懸浮培養(yǎng)工藝生產(chǎn)FMD疫苗。通常MOI為0.01即可在20 h內(nèi)使90%的細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞病變。（MOI：感染比即1個(gè)感染單位/100個(gè)細(xì)胞使用）

2.滅活及滅活檢驗(yàn)。病毒滅活及滅活檢驗(yàn)在FMD疫苗生產(chǎn)中是最關(guān)鍵的步驟之一，歷史上一些疫病的暴發(fā)與FMDV滅活不徹底有直接的關(guān)系。最早，人們采用甲醛滅活FMDV，通過病毒蛋白交聯(lián)而滅活病毒，對(duì)病毒核酸沒有改變，難以確定病毒何時(shí)滅活完全。隨后，氮丙啶類如AEI被用于病毒滅活，該類滅活劑作用于病毒核酸，抗原蛋白不受破壞，能很好的保持病毒的免疫原性，但毒性較大。目前，BEI是FMD疫苗生產(chǎn)的主要滅活劑，這種化學(xué)試劑滅活病毒能繪制出清晰的病毒滅活曲線，符合一級(jí)滅活動(dòng)力曲線，對(duì)病毒安全，能保證病毒的抗原性，而且滅活徹底。對(duì)于不穩(wěn)定的疫苗株而言，采用甲醛和BEI共同滅活工藝能夠顯著縮短滅活的時(shí)間，可由原來的40 h縮短到8 h左右，而且更加安全。2008年出版的《OIE陸生動(dòng)物衛(wèi)生法典》中建議，F(xiàn)MDV滅活采用0.3 mM BEI濃度2次滅活，為了徹底的滅活病毒，不使病毒逃逸，在工業(yè)生產(chǎn)中，一般要將一個(gè)滅活罐倒到另一個(gè)滅活罐。

滅活抗原的安全性通過敏感單層細(xì)胞或乳鼠傳代試驗(yàn)證實(shí)。將滅活的抗原液接種到單層細(xì)胞，連續(xù)傳代2～3代，無CPE；樣品接種乳鼠后，連續(xù)觀察7 d，應(yīng)全部健活，10 000 L病毒懸液中的活病毒粒子應(yīng)少于1個(gè)。

3.抗原濃縮和純化。滅活疫苗刺激有效的免疫應(yīng)答需要大量的抗原量，而且病毒增殖過程中的副產(chǎn)品如血清蛋白和病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白都會(huì)造成被免疫動(dòng)物的過敏反應(yīng)。因此，應(yīng)通過離心或沉淀等方法去除細(xì)胞碎片或者在接種病毒前將含血清培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)病毒。

4.乳化。乳化是為了提高疫苗的免疫原性，將滅活好的抗原與佐劑以一定比例混合。一般常用的免疫佐劑有氫氧化鋁膠、皂甙和油佐劑。氫氧化鋁佐劑和皂甙用于FMD疫苗能顯著的保護(hù)牛免受FMDV的攻擊，但對(duì)豬的免疫保護(hù)力相對(duì)較低，這種疫苗在中東和亞洲部分地區(qū)仍在使用。1945年，油佐劑開始應(yīng)用于FMD疫苗，油佐劑疫苗對(duì)牛和豬均能產(chǎn)生良好的保護(hù)力，疫苗的免疫持續(xù)期長，在其中加入Tween-80，可降低疫苗的黏度。黏度小、穩(wěn)定性好和乳化簡便的油佐劑一直在不斷的發(fā)展和改進(jìn)，如ISA206以及近些年來發(fā)展起來的“即用型”（Ready-to-use）油佐劑，將逐漸取代鋁膠和皂甙等傳統(tǒng)佐劑。

五、疫苗質(zhì)量控制

疫苗的質(zhì)量控制是保證疫苗安全、有效的重要手段。好的疫苗不僅需要良好的毒株、符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的原材料、控制抗原生產(chǎn)過程的抗原含量和病毒滴度，還要做好病毒的滅活和乳化工作，成品檢驗(yàn)中把好無菌檢驗(yàn)、安全性檢驗(yàn)和效力檢驗(yàn)等環(huán)節(jié)。

滅活疫苗誘發(fā)免疫應(yīng)答通常需要大量的抗原含量，而且疫苗中的非病毒蛋白常常引起過敏反應(yīng)，尤其在制造多價(jià)疫苗的時(shí)候，必須要對(duì)病毒抗原進(jìn)行純化濃縮，以達(dá)到增加抗原含量和減少疫苗變態(tài)反應(yīng)的目的。目前常用的濃縮方法有：1.氯仿處理；2.氫氧化鋁膠處理；3.超濾處理；4.PEG處理。

抗原定量檢測技術(shù)補(bǔ)體結(jié)合（CF）試驗(yàn)、定量蔗糖梯度密度分析法等可以直接測量計(jì)算出抗原中完整口蹄疫病毒粒子146S的值（ng/ml）,從而定量配制疫苗。

FMD疫苗的效力試驗(yàn)，是通過PD50來表示，常規(guī)疫苗需至少達(dá)到3PD50，緊急接種疫苗需至少達(dá)到6PD50。目前，發(fā)達(dá)國家已經(jīng)采用本動(dòng)物替代方法檢測FMD疫苗的效力，該檢測方法也是我國FMD疫苗生產(chǎn)中急需解決的關(guān)鍵技術(shù)之一。

生產(chǎn)較高質(zhì)量的疫苗必須有完全符合國家GMP要求的車間、硬件、設(shè)備、設(shè)施、檢驗(yàn)室、符合要求的動(dòng)物基地等。

質(zhì)量保證機(jī)構(gòu)：QA和QC及合格的供應(yīng)穩(wěn)定的供應(yīng)商。

六、疫苗在FMD防控中的作用

滅活疫苗由于其可靠的安全性和良好的免疫效果，在FMD控制和消滅方面受到人們的廣泛承認(rèn)，由最初的感染動(dòng)物組織病毒制成的甲醛滅活疫苗到目前的懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)病毒制成的油佐劑疫苗，使FMD疫苗制造成本更加廉價(jià)穩(wěn)定。到目前為止，F(xiàn)MD滅活疫苗無論從佐劑、滅活劑還是病毒抗原制備等均取得了很大的成就。但也有不足之處：對(duì)于有效的免疫，疫苗的抗原含量要保證，生物安全防護(hù)級(jí)別較高，滅活不完全可能導(dǎo)致散毒，另外，滅活疫苗的生產(chǎn)成本較高。鑒于上述原因，在研制高質(zhì)量FMD疫苗時(shí)，除了選擇免疫原性好，廣普性強(qiáng)以及適應(yīng)病毒生長的基質(zhì)外，還需要對(duì)病毒的免疫機(jī)理作深入的研究分析，從疫苗制造的多個(gè)環(huán)節(jié)提高疫苗的安全性和免疫效力。

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，基因工程疫苗是未來的發(fā)展方向，并已經(jīng)取得了一定的成果，同時(shí)，新型基因疫苗進(jìn)入實(shí)際應(yīng)用，需要對(duì)FMDV免疫機(jī)制和分子特性做深入的研究。

（略）