間充質(zhì)干細(xì)胞治療急性肺損傷的研究進(jìn)展*

喬 坤 江其生 鄒 躍

(1.泰山醫(yī)學(xué)院研究生部，山東 泰安 271000；2.第二炮兵總醫(yī)院，北京 100088)

急性肺損傷( acute lung injury,ALI)是一種常見的危重癥，是重癥患者發(fā)生急性呼吸衰竭的主要原因，也往往是多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome MODS)中最早出現(xiàn)的器官功能障礙。由于缺乏有效的治療措施,迄今其死亡率仍高達(dá)40%[1,2]。近年來，隨著間充質(zhì)干細(xì)胞技術(shù)的研究發(fā)展，通過干細(xì)胞移植減輕肺水腫等炎癥反應(yīng)成為可能。因此，干細(xì)胞移植有望成為一種有效治療急性肺損傷的新方法。

1 急性肺損傷的發(fā)生機制

急性肺損傷是指機體遭受嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷、休克、酸中毒及有害氣體吸入等多種因素刺激后，出現(xiàn)彌漫性肺泡-毛細(xì)血管膜損傷所致肺水腫和微肺不張等病理過程，臨床表現(xiàn)為呼吸窘迫和頑固性低氧血癥。

ALI的發(fā)生機制尚未完全闡明，除有些致病因素對肺泡膜的直接損傷外，更重要的是多種炎癥細(xì)胞及其釋放的炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子間接介導(dǎo)的肺炎癥反應(yīng)，最終引起肺泡膜損傷、通透性增加和微血栓形成；并可造成肺泡上皮損傷，表面活性物質(zhì)減少或消失，加重肺水腫和肺不張，從而引起肺的氣體交換功能障礙，導(dǎo)致頑固性低氧血癥。

參與ALI發(fā)病過程的細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)機制，尚有待深入研究，但目前研究發(fā)現(xiàn)，很多導(dǎo)致ALI發(fā)生的因素能夠延遲中性粒細(xì)胞凋亡，引起過度和失控的炎癥反應(yīng)。除中性粒細(xì)胞外，巨噬細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞可以分泌腫瘤壞死因子-α(TNFα)、白細(xì)胞介素-1(IL-1)等炎性介質(zhì)。肺內(nèi)炎性介質(zhì)和抗炎介質(zhì)的平衡失調(diào)，是ALI發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

2 MSC來源與特性

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell MSC)是來源于中胚層的成體干細(xì)胞，具有自我更新和多向分化潛能,在一定條件下不但可以分化成多種中胚層來源的間質(zhì)細(xì)胞[2]，也可以跨胚層分化為外胚層的神經(jīng)元和上皮組織，還可以分化成內(nèi)胚層的心肌細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞[3]，是具有多能干細(xì)胞特性的細(xì)胞群。MSC具有高度的擴(kuò)增能力；能與各種病毒載體結(jié)合,并可進(jìn)行各種基因的轉(zhuǎn)染,既能保持本身的基因穩(wěn)定性,又能高效地表達(dá)所轉(zhuǎn)染基因；多分化潛能，具備潛在修復(fù)各種組織器官的能力。

實驗證實：通過向體內(nèi)植入間充質(zhì)干細(xì)胞，使其歸巢至受損肺組織后可分化成肺上皮細(xì)胞和肺血管內(nèi)皮細(xì)胞，調(diào)節(jié)急性肺損傷的炎癥反應(yīng)，參與修復(fù)損傷的肺組織[4,5]。

3 外源MSC參與肺組織損傷修復(fù)機制

3.1 在局部微環(huán)境作用下，誘導(dǎo)分化為肺泡上皮細(xì)胞和肺血管內(nèi)皮細(xì)胞等結(jié)構(gòu)細(xì)胞，參與肺組織的修復(fù)過程。

3.1.1間充質(zhì)干細(xì)胞的歸巢

移植入體內(nèi)的干細(xì)胞能夠歸巢到肺損傷和炎癥部位。肺損傷后，壞死肺組織細(xì)胞可能通過釋放出一系列的趨化信號如間質(zhì)衍生因子1(stromal cell-derived factor-1，SDF-1)、CXCL2、血管內(nèi)皮生長因子等，對骨髓衍生細(xì)胞具有吸引作用[6-9]，并刺激內(nèi)皮祖細(xì)胞快速動員到血液循環(huán)中。Rojas 等將MSCs 移植到博萊霉素誘導(dǎo)的肺損傷小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)輸入體內(nèi)的MSCs 能定向遷移到肺損傷區(qū)域并分化為特定的肺細(xì)胞表型[10]。

3.1.2間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)的分化

歸巢至受損部位的間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)分化成為肺上皮細(xì)胞時才能發(fā)揮修復(fù)功能。Sueblinvong等研究發(fā)現(xiàn)人臍帶血來源的間充質(zhì)干細(xì)胞在體外培養(yǎng)時，可以轉(zhuǎn)化為肺Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞,并表達(dá)表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白C ( surfactant protein C, SP-C) 和Clara 細(xì)胞分泌蛋白(Clara cell secretory protein, CCSP)[11]。Popov等使用GFP轉(zhuǎn)基因鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與肺上皮的A549細(xì)胞共培養(yǎng)時，得到的間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)出上皮細(xì)胞的標(biāo)志如細(xì)胞角蛋白5、8、14、18、19 SP-C。這表明是肺上皮細(xì)胞通過旁分泌作用誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化[12]。Wong等研究發(fā)現(xiàn)CD73, CD90 和 CD105的間充質(zhì)干細(xì)胞在體外培養(yǎng)時可以轉(zhuǎn)化為Clara+ 細(xì)胞，并表達(dá)SP-C 、CCSP。通過靜脈注射和氣管內(nèi)直接灌注這些Clara+ 細(xì)胞可以歸巢至受損組織并轉(zhuǎn)化為肺泡上皮細(xì)胞[13]。肺損傷體內(nèi)試驗研究表明，肺損傷小鼠移植MSCs后，供體來源的MSCs能在LPS誘導(dǎo)的受損肺組織定植分化。MSCs可以轉(zhuǎn)化為肺泡Ⅱ型(typeⅡalveolar epithelial cell, AECⅡ)和Ⅰ型上皮細(xì)胞(typeⅠalveolar epithelial cell,AECⅠ)來修復(fù)損傷的肺組織，修復(fù)肺臟功能[14]。

3.1.3誘導(dǎo)肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞的恢復(fù)與再生，減少肺血管的通透性

間充質(zhì)干細(xì)胞可以誘導(dǎo)肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞的恢復(fù)與再生。Mao等人將男性捐獻(xiàn)者的間充質(zhì)干細(xì)胞由靜脈注射到脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷雌性大鼠體內(nèi)。采用原位雜交和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)雌鼠再生的肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞中含有Y染色體。并且干細(xì)胞注射組與生理鹽水治療的對照組相比，間充質(zhì)干細(xì)胞組明顯的減少了肺水腫，肺出血，與透明膜的形成，增加存活率[15]。Zhao實驗指出MSCs不但促進(jìn)了肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞的恢復(fù)與再生，保證肺動脈內(nèi)皮的完整性，還抑制肌球蛋白輕鏈(MLC)的磷酸化, 保護(hù)血管內(nèi)皮鈣粘蛋白和細(xì)胞分裂周期蛋白42(Cdc42)活性增加, 防止凝血酶誘導(dǎo)增加肺血管通透性，減少肺水腫的發(fā)生，減輕急性肺損傷[16]。

3.2 調(diào)節(jié)急性肺損傷的炎性反應(yīng)，為損傷修復(fù)提供有利的環(huán)境基礎(chǔ)

在ALI中中性粒細(xì)胞通過產(chǎn)生毒素和細(xì)胞因子介導(dǎo)肺組織的損傷。間充質(zhì)干細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)特性，通過釋放TGF-β, PGE2, IDO, IL-10和IL-1 受體拮抗劑(IL-1RA)等細(xì)胞因子，抑制T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞的活性，抑制炎性細(xì)胞因子釋放，下調(diào)促炎癥反應(yīng)[17,18]，促進(jìn)受損細(xì)胞生存。可以通過旁分泌來抑制巨噬細(xì)胞分泌TNFα減輕由膿毒血癥所釋放出的前列腺素E2水平，增強單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌IL-10的能力[19]，也可以通過旁分泌來釋放出IL-1RA，來減輕博來霉素誘導(dǎo)的肺損傷。Lee等研究也發(fā)現(xiàn)移植MSC后，通過下調(diào)一氧化氮代謝、炎性細(xì)胞因子和血管性細(xì)胞因子水平， MSC移植組明顯的減輕博來霉素誘導(dǎo)的肺損傷后的肺臟濕/干比，減少了中性粒細(xì)胞浸潤，膠原沉積程度，以及炎性細(xì)胞因子水平[20]。

Gupta等人研究表明在氣管內(nèi)給予內(nèi)毒素4小時后再在氣管內(nèi)給予間充質(zhì)干細(xì)胞與只用內(nèi)毒素處理的小鼠相比，能夠減少小鼠死亡率和肺水腫發(fā)生。MSCs治療組中支氣管肺泡灌洗液和血漿中MIP-2和TNFα以及支氣管肺泡灌洗液中蛋白質(zhì)的水平明顯降低，同時支氣管肺泡灌洗液和血漿中的抗炎細(xì)胞因子IL-10水平顯著升高[21]。使用PBS替代MSCs的實驗組中沒有減輕內(nèi)毒素誘導(dǎo)的促炎反應(yīng)，支氣管肺泡灌洗液和血漿中MIP-2和TNFα以及支氣管肺泡灌洗液中蛋白質(zhì)的水平?jīng)]有發(fā)生改變。MSCs與肺巨噬細(xì)胞共同培養(yǎng)的研究表明MSC的抗炎效應(yīng)是通過旁分泌產(chǎn)生的[21]。

MSCs除了可以調(diào)節(jié)外周炎癥細(xì)胞因子外，還可以分泌白介素1受體拮抗劑(IL-1RA)。Ortiz等實驗發(fā)現(xiàn)，通過人MSCs產(chǎn)生的IL-1RA減輕了博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺損傷，可以明顯減少肺膠原蛋白的堆積，減少肺纖維化[22]。ALI引起肺泡上皮屏障的破壞，出現(xiàn)肺水腫，并且液體中含有大量的IL-1β, IL-8, TNFα 和TGFβ1。MSCs可以產(chǎn)生多種細(xì)胞因子如角蛋白生長因子(KGF)，增加Na-K ATP泵的活性，增強肺泡液體的轉(zhuǎn)運，減輕肺損傷的程度。Lee等人的實驗發(fā)現(xiàn)內(nèi)毒素介導(dǎo)的ALI發(fā)生損傷一小時后將MSCs注入肺支氣管中，KGF的含量升高，肺泡液體清除率恢復(fù)到正常水平[23]。Fang等試驗發(fā)現(xiàn)通過I131標(biāo)記的白蛋白來檢測肺泡 II型上皮細(xì)胞對蛋白的通透性。在細(xì)胞因子導(dǎo)致的ALI 24小時后發(fā)現(xiàn)蛋白通透性提高了5倍， MSCs能夠恢復(fù)ALI后肺泡 II型上皮細(xì)胞對蛋白質(zhì)的通透性到對照水平，減少膠原蛋白的滲出，減輕ALI后的肺水腫[24]。MSCs恢復(fù)肺泡 II型上皮細(xì)胞對蛋白通透性的作用是通過旁分泌血管生成素-1(angiopoietin-1 Ang1)進(jìn)行的。

3.3 作為基因治療的載體修復(fù)損傷的肺組織，修復(fù)肺臟功能

BMSC還可作為基因治療的載體,攜帶Ang1基因進(jìn)入受損傷的肺組織，減輕血管內(nèi)皮的通透性,抑制炎性細(xì)胞的聚集;與BMSCs的治療作用產(chǎn)生協(xié)同作用[25]。Mei等發(fā)現(xiàn)移植MSCs能顯著降低LPS誘發(fā)肺損傷的肺灌洗液中細(xì)胞總數(shù)和中性白細(xì)胞計數(shù)，顯著降低肺灌洗液和肺組織勻漿中的炎性細(xì)胞因子；移植攜帶人類Ang1基因的MSCs 能進(jìn)一步改善LPS誘發(fā)的肺的炎癥，幾乎完全逆轉(zhuǎn)LPS誘發(fā)肺泡膜通透性的增加[26]。

4 評價指標(biāo)和療效

研究間充質(zhì)干細(xì)胞參與修復(fù)損傷的肺組織的觀察指標(biāo)主要有：1)通過檢測血漿和支氣管肺泡灌洗液中MSCs在體內(nèi)活動性指標(biāo)，例如角質(zhì)細(xì)胞生長因子，Ang1，前列腺素-2，IL-10，IL-1RA[27]。2)支氣管肺泡灌洗液中細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞計數(shù)、支氣管肺泡灌洗液和肺組織蛋白含量、肺組織干濕比及肺組織的形態(tài)學(xué)變化[28]。研究發(fā)現(xiàn)在LPS介導(dǎo)的ALI中使用MSCs組的支氣管肺泡灌洗液中中性粒細(xì)胞數(shù)明顯低于使用生理鹽水組[26]。Ortiz等實驗發(fā)現(xiàn),通過人MSCs產(chǎn)生的IL-1RA減輕了博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺損傷，可以明顯減少肺膠原蛋白的堆積，減少肺纖維化。MSCs治療組中支氣管肺泡灌洗液和血漿中MIP-2和TNFα的水平明顯降低。使用PBS替代MSCs的實驗組中沒有減輕內(nèi)毒素誘導(dǎo)的促炎反應(yīng)，支氣管肺泡灌洗液和血漿中MIP-2和TNFα的水平?jīng)]有發(fā)生改變。同時支氣管肺泡灌洗液和血漿中的IL-10水平顯著升高[22]。

5 問題與展望

目前ALI的治療主要是支持療法，探索新的治療方法十分必要。近年來干細(xì)胞在諸如急性心肌梗死、糖尿病、敗血癥、急性腎功能衰竭、腦出血等模型的研究探索取得了迅速發(fā)展，積累了豐富的資料，為干細(xì)胞在ALI治療中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。隨著干細(xì)胞生物學(xué)研究的不斷深入,對干細(xì)胞在肺損傷修復(fù)中作用的認(rèn)識也在不斷提高。急性肺損傷后進(jìn)行間充質(zhì)干細(xì)胞移植，MSCs能定向分化為肺泡上皮細(xì)胞與肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，這些都是其它治療方法無法做到的。MSCs易于培養(yǎng)擴(kuò)增，無須人類白細(xì)胞抗原配型，易于研究和應(yīng)用。干細(xì)胞介導(dǎo)治療急性肺損傷的研究雖取得了一定的進(jìn)展，但仍有許多問題亟待解決:1)如何有效地提取“純的”干細(xì)胞，有待于對干細(xì)胞學(xué)特點及各階段分化細(xì)胞標(biāo)志物的研究。2)干細(xì)胞經(jīng)體外大量擴(kuò)增后，如何能很好地保持多能干細(xì)胞的生物學(xué)特性，避免基因突變。3)干細(xì)胞植入體內(nèi)后是否會引起其它器質(zhì)性疾病，甚至發(fā)生癌變的可能，都需要進(jìn)一步的研究。

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