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    以次黃嘌呤單核苷酸脫氫酶為靶點的新型抗結(jié)核藥物高通量篩選模型的建立及應(yīng)用

    2011-04-11 05:40:08熊小椒周爽楊延輝關(guān)艷肖春玲
    中國醫(yī)藥生物技術(shù) 2011年6期
    關(guān)鍵詞:次黃嘌呤脫氫酶核苷酸

    熊小椒,周爽,楊延輝,關(guān)艷,肖春玲

    ·論著·

    以次黃嘌呤單核苷酸脫氫酶為靶點的新型抗結(jié)核藥物高通量篩選模型的建立及應(yīng)用

    熊小椒,周爽,楊延輝,關(guān)艷,肖春玲

    目的建立以結(jié)核分枝桿菌次黃嘌呤單核苷酸脫氫酶為靶點的新型抗結(jié)核藥物高通量篩選模型。

    抗結(jié)核藥; 次黃嘌呤類; 藥物評價,臨床前

    www.cmbp.net.cn 中國醫(yī)藥生物技術(shù), 2011, 6(6):445-449

    近年來,結(jié)核病發(fā)病率的不斷攀升使其又一次成為威脅人類健康的重大傳染病之一。結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)的耐藥問題日趨嚴(yán)重,結(jié)核病與艾滋病共感染現(xiàn)象不斷增加,使結(jié)核病疫情的防控面臨著更為嚴(yán)峻的問題[1-2],也使新型抗結(jié)核藥物的開發(fā)迫在眉睫。

    次黃嘌呤單核苷酸脫氫酶(IMPDH)是 MTB從頭合成鳥嘌呤核苷酸(GMP)途徑的關(guān)鍵酶。IMPDH 能夠以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)作為受氫體,將次黃嘌呤核苷酸(IMP)氧化生成黃嘌呤核苷酸(XMP),而 XMP 正是生命體從頭合成 GMP 的前體物質(zhì)。所以,抑制 IMPDH 的活性可以阻止 GMP 的合成,從而抑制 MTB 的生長和增殖。Sassetti 等[3]的研究也證明,編碼 IMPDH 的基因為 MTB 生長所必需。而 MTB 的 IMPDH和人源 IMPDH 在其 IMP 結(jié)合位點上的核苷酸抑制因子結(jié)合區(qū)有很大不同[4]。所以,MTB IMPDH是新型抗結(jié)核藥物的潛在靶點,使研發(fā)選擇性抑制MTB 的藥物成為可能。

    MTB H37Rv 基因組中包含有 3 個編碼IMPDH 的基因[5]:guaB1(Rv1843c)、guaB2 (Rv3411c)和 guaB3(Rv3410c)。轉(zhuǎn)座子突變研究已經(jīng)表明,MTB 的 guaB2 基因是這 3 個基因中唯一的必需基因[3]。

    本研究通過在體外測定重組表達(dá)的 MTB GuaB2 蛋白活性,建立了 MTB GuaB2 抑制劑的高通量篩選(HTS)模型,為發(fā)現(xiàn)潛在的具有 MTB GuaB2 抑制作用的新型藥物提供了一種快速有效的方法。

    1 材料與方法

    1.1 儀器與材料

    Hi-trap Fast Flow 親和層析柱、PD-10 脫鹽柱(SephadexTMG-25)AKTA 蛋白純化儀均為美國GE 公司產(chǎn)品;PCR 儀(DNA Engine peltier Thermal Cycler)為美國 Biorad 公司產(chǎn)品;AH 高壓勻漿儀(AH-Basic)為加拿大 Ats engineering Inc. 公司產(chǎn)品;Envision 酶標(biāo)儀為美國 Perkin Elmer 公司產(chǎn)品。

    NAD+購自美國 Sigma 公司;IMP 購自英國Acros Organics 公司;IPTG 購自美國 Merck 公司;DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)購自加拿大 Fermentas公司;引物合成和質(zhì)粒序列測定由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。表達(dá)載體 pBEV 由美國 Vertex 制藥公司提供;大腸桿菌 DH5α 和大腸桿菌 BL21(DE3)pLysS 質(zhì)粒受體菌購自北京天根生物公司。

    1.2 方法

    1.2.1MTB GuaB2 的表達(dá)與純化 以 MTB H37Rv 基因組為模板,GuaB2nt1:5′ AATGGCATA TGTCCCGTGGCATGTC 3′ 和 GuaB2nt2:5′ TAAA CCTCGAGTTAGCGCGCGTAGT 3′ 為引物(下劃線為酶切位點),經(jīng) PCR 擴增,條件為:94 ℃ 預(yù)變性 3 min;94 ℃ 變性 30 s,55 ℃ 復(fù)性 30 s,72 ℃ 延伸 3.5 min,32 個循環(huán);最后 72 ℃ 反應(yīng)10 min。NdeI 和XhoI 雙酶切后與表達(dá)載體pBEV連接,轉(zhuǎn)化入E.coliDH5α,用含 100 mg/L氨芐青霉素(Amp)LB 平板篩選陽性克隆子。將測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E.coliBL21(DE3)pLysS,在含 100 mg/L Amp 和 34 mg/L 氯霉素的 BHI 平板上篩選得到 GuaB2 蛋白穩(wěn)定表達(dá)菌株?;静僮鲄⒁姺肿涌寺嶒炛改蟍6]。挑取單菌落于 BHI液體培養(yǎng)基中 37 ℃、200 r/min 過夜培養(yǎng),以 1∶50的比例接種于 BHI 培養(yǎng)基中,培養(yǎng)至OD600= 0.4 ~ 0.6。加入 IPTG 至終濃度為 1 mmol/L,28 ℃,200 r/min 誘導(dǎo) 10 h。低溫離心收集菌體,用細(xì)胞壓力破碎儀在 8 × 107Pa 條件下破碎菌體 2 遍,用 Ni2+親和色譜法進(jìn)行蛋白純化。聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后,用考馬斯亮藍(lán)染色,觀察蛋白表達(dá)、純化情況。將凝膠內(nèi)蛋白條帶電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上,5% 脫脂奶粉封閉 2 h,加入His-tag 單克隆抗體,4 ℃ 過夜。加入 lgG-HRP 二抗,室溫 2 h,增強型化學(xué)發(fā)光試劑(enhanced chemilum inescence,ECL)發(fā)光,顯影。

    1.2.2酶活性測定及篩選條件的優(yōu)化 于 96 孔酶標(biāo)板中加入 GuaB2 活性測定緩沖體系[100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0),100 mmol/L KCl,2.5 mmol/L EDTA及1 mmol/L DTT],100 mmol/L 的 IMP 0.5 μl 和 100 mmol/L 的 NAD+2.5 μl,GuaB2 1 μg,使每孔終體積為 100 μl。在 25 ℃ 條件下檢測 340 nm 波長的光吸收值(OD340)變化。優(yōu)化參數(shù)包括:反應(yīng)底物 IMP(1.5 ~ 0.0117 μmol/L,對倍稀釋)和 NAD+的濃度(10 ~ 0.0781 μmol/L,對倍稀釋),25 ℃ 下酶促反應(yīng)時間(10 ~ 70 min,間隔 10 min),酶量(8.24 ~ 0.26 U,對倍稀釋)。

    1.2.3酶抑制劑的高通量篩選 以優(yōu)化后的反應(yīng)條件進(jìn)行篩選,每塊 96 孔酶標(biāo)板上設(shè) 80 個待篩樣品孔及 4 個陽性對照孔和 4 個陰性對照孔。由于目前沒有已報道的 MTB GuaB2 酶抑制劑,本研究以加入熱變性酶作為陽性對照。每孔加入待測樣品終濃度為 10 μg/ml,在 25 ℃ 條件下檢測30 min 內(nèi)反應(yīng)體系OD340的變化,計算酶的反應(yīng)速率。利用反應(yīng)速率計算樣品對 GuaB2 的抑制率(R):R(%)=(1 - VS/VN)× 100%。其中 VS代表待測樣品孔的酶反應(yīng)速率;VN代表陰性對照孔的平均酶反應(yīng)速率。

    根據(jù)以上條件,我們對本所藥用化合物樣品庫中的 1765 個化合物進(jìn)行了初篩,選擇抑制率 ≥50% 的樣品作為活性樣品,按照初篩的反應(yīng)條件和方法進(jìn)行復(fù)篩。根據(jù)復(fù)篩結(jié)果,確定 GuaB2 抑制劑的抑制率。

    1.2.4高通量篩選模型的評價 Z’ 因子法是評價HTS 模型的一種重要方法。根據(jù)公式計算 Z’ 因子值:Z’ = 1 - 3(SDn + SDp)/(Vn - Vp)。其中 Vn 和 SDn 分別為陰性對照孔的酶反應(yīng)速率平均值和標(biāo)準(zhǔn)差;Vp 和 SDp 分別代表陽性對照孔的酶反應(yīng)速率平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

    2 結(jié)果

    2.1 GuaB2 表達(dá)載體的構(gòu)建

    PCR 產(chǎn)物經(jīng) 1% 的瓊脂糖凝膠電泳鑒定,得到了長度為 1590 bp 的guaB2 基因(圖1)。選取經(jīng)PCR 驗證為陽性的菌落,提取質(zhì)粒,用雙酶切的方法進(jìn)一步驗證(圖2)。酶切鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行測序分析經(jīng)比對與 GeneBank 中 MTB 的guaB2 基因序列一致。

    圖1 guaB2 的 PCR 擴增結(jié)果Figure 1 PCR product ofguaB2

    圖2 pBEV::guaB2 的雙酶切驗證Figure 2 Restriction enzymatic analysis of pBEV::guaB2

    2.2 GuaB2 的表達(dá)及純化

    對表達(dá)純化得到的 GuaB2 蛋白進(jìn)行 SDSPAGE 分析,相對分子質(zhì)量約為 57 kD,與理論預(yù)期值一致。純化得到的融合蛋白可見單一條帶。經(jīng)western blot 鑒定,結(jié)果表明該蛋白條帶確為 GuaB2融合蛋白(圖3)。

    圖3 His-GuaB2 蛋白的純化及 western blot 檢測 His-GuaB2 的表達(dá)Figure 3 Purification of His-GuaB2 and western blot analysis of the expression of His-GuaB2

    圖4 篩選條件的優(yōu)化Figure 4 Optimization of screening conditions

    2.3 酶活性測定及篩選條件優(yōu)化

    GuaB2 酶活測定原理是應(yīng)用吸光光度法檢測酶催化反應(yīng)產(chǎn)物 NADH。GuaB2 酶活力的定義:25 ℃ 條件下反應(yīng),每分鐘內(nèi)催化生成 1 μmol/L底物的酶量設(shè)定為 1 U。純化脫鹽后的 GuaB2 為0.2 mg/ml,酶比活力為 736 U/mg。對篩選體系進(jìn)行優(yōu)化,最佳的篩選條件是 IMP 的濃度為0.5 mmol/L;NAD+濃度為 2.5 mmol/L;酶促反應(yīng)時間 30 min;GuaB 酶量為 4 U/孔(圖4)。

    2.4 篩選方法的評估

    目前廣泛使用的 HTS 模型的穩(wěn)定性和可靠性評估參數(shù)是 Z’ 因子[7],它是一個統(tǒng)計學(xué)參數(shù),與篩選源無關(guān),僅與篩選方法本身有關(guān)。一般認(rèn)為,如果 Z’ > 0.5,說明該篩選模型是比較理想的適合于 HTS 的方法;如果 Z’ < 0.5,則說明篩選方法還需要調(diào)整。本實驗中 HTS 的 Z’ 因子值為 0.68(圖5)。因此,所建立的篩選方法是一種穩(wěn)定性和靈敏度都較好的 HTS 方法。

    圖5 評價 GuaB2 抑制劑高通量篩選方法(Z’ ≈ 0.68)Figure 5 Evaluation of the HTS method for inhibitors of GuaB2 (Z’ ≈ 0.68)

    2.5 GuaB2 抑制劑的篩選

    采用建立的 HTS 模型,對本所藥用化合物庫中 1765 個化合物進(jìn)行篩選。初篩發(fā)現(xiàn)抑制率 >50% 的樣品 23 個,進(jìn)行復(fù)篩得到抑制活性較好的5 個化合物,其化合物編號及其對重組 MTB GuaB2 的抑制率見表 1。

    表1 各活性化合物在 10 μg/ml 濃度下對 GuaB2 的抑制率Table 1 The inhibition ratio of recombinant H37Rv GuaB2 activity by 10 μg/ml active compounds

    3 討論

    近年來已有研究證明,抑制 IMPDH 的活性可以阻止生命體在生長和增殖過程中所需 GMP 的供應(yīng),從而達(dá)到治療癌癥、自身免疫性疾病、病原微生物(病毒、原蟲以及細(xì)菌)感染疾病的目的[8]。目前,微生物體內(nèi)的 IMPDH 作為抗菌藥物發(fā)現(xiàn)的潛在靶點越來越受到重視。例如,已經(jīng)通過 HTS的方法得到了微小隱孢子蟲(Cryptosporidium parvum)IMPDH 的有效抑制劑[9-10]。相關(guān)研究已經(jīng)表明,MTB IMPDH 是研發(fā)新型抗結(jié)核藥物的優(yōu)良潛在靶點,建立以 MTB IMPDH 為靶點的 HTS模型以發(fā)現(xiàn)具有 GuaB2 抑制作用的藥物對于結(jié)核病的治療將具有重要的意義。

    本實驗構(gòu)建了 MTB GuaB2 的表達(dá)質(zhì)粒pBEV::guaB2,純化得到了可溶性蛋白,依據(jù)反應(yīng)產(chǎn)物 NADH 的吸收特性對 MTB GuaB2 蛋白的活性進(jìn)行測定。通過對反應(yīng)體系的優(yōu)化,建立了GuaB2 抑制劑的 HTS 模型,其 Z’ 因子值達(dá)到了0.68。應(yīng)用該模型,對 1765 個化合物進(jìn)行了篩選。結(jié)果表明,該模型具有微量、快速、靈敏、穩(wěn)定等特點,為尋找和發(fā)現(xiàn) MTB GuaB2 抑制劑提供了一種新的技術(shù)和方法。建立 GuaB2 抑制劑 HTS 模型的最終目的是發(fā)現(xiàn)活性先導(dǎo)化合物,利用該模型在我所化合物庫中發(fā)現(xiàn)了有較強 GuaB2 活性抑制作用的化合物 2 個(抑制率 > 80%),具有進(jìn)一步深入研究的意義。但是,利用該方法篩選獲得的活性化合物,僅能證明其在體外具有 GuaB2 抑制作用,還需要進(jìn)行更多的研究以全面評價其體內(nèi)外活性,以便將這些活性化合物開發(fā)成新的抗結(jié)核藥物。

    [1] Zhang Y. The magic bullets and tuberculosis drug targets. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 2005, 45:529-564.

    [2] Das P, Horton R. Tuberculosis--time to accelerate progress. Lancet, 2010, 375(9728):1755-1757.

    [3] Sassetti CM, Boyd DH, Rubin EJ. Genes required for mycobacterial growth defined by high density mutagenesis. Mol Microbiol, 2003, 48(1):77-84.

    [4] Shu Q, Nair V. Inosine monophosphate dehydrogenase (IMPDH) as atarget in drug discovery. Med Res Rev, 2008, 28(2):219-232.

    [5] Cole ST, Brosch R, Parkhill J, et al. Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence. Nature, 1998, 393(6685):537-544.

    [6] Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning. Jin DY, Li MF, Translation. 2nd ed. Beijing: Science Press, 1992:34-55. (in Chinese)薩姆布魯克, E.F沸里奇, 曼尼阿蒂斯. 分子克隆實驗指南. 金冬燕,黎孟楓, 譯. 2版. 北京: 科學(xué)出版社, 1992:34-55.

    [7] Zhang JH, Chung TD, Oldenburg KR. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. J Biomol Screen, 1999, 4(2):67-73.

    [8] Hedstrom L. IMP dehydrogenase: structure, mechanisum, and inhibition. Chem Rev, 2009, 109(7):2903-2928.

    [9] Umejiego NN, Gollapalli D, Sharling L, et al. Targeting a prokaryotic protein in a eukaryotic pathogen: identification of lead compounds against cryptosporidiosis. Chem Rev, 2008, 15(1):70-77.

    [10] Maurya SK, Gollapalli DR, Kirubakaran S, et al. Triazole inhibitors of Cryptosporidium parvum inosine 5’-monophosphate dehydrogenase. J Med Chem, 2009, 52:4623-4630.

    Establishment and application of a novel high-throughput scr eening model targeting to inosine monophosphate dehydrogenase for antitubercular drugs

    XIONG Xiao-jiao, ZHOU Shuang, YANG Yan-hui, GUAN Yan, XIAO Chun-ling

    ObjectiveTo establish a high-throughput (HTS) screening model targeting inosine monophosphate dehydrogenase (IMPDH) for the discovery of novel antitubercular drugs.MethodsThe H37Rv IMPDH coding gene guaB2 was amplified and cloned into pBEV expression vector. The recombinant GuaB2 protein was expressed in Escherichia coli BL21(DE3)pLysS and itsactivity was measured at 340 nm wavelength absorbance. HTS screening model was established based on the activity of GuaB2 and Z’ factor was used to evaluate the quality of the HTS model. Total of 1765 compounds were screened for the inhibition of GuaB2 activity with the model.ResultsRecombinant H37Rv GuaB2 vector was successfully constructed and expressed, with the optimal enzymatic activity being 736 U/mg for the GuaB2 protein. The parameter Z’ factor was 0.68, suggesting that the HTS model was highly feasible and stable for drug screening. In order to test the HTS model, 1765 compounds were screened and 5 compounds were found to inhibit GuaB2 activity, showing the 0.28% positive rate.ConclusionA steady and sensitive HTS model for potential GuaB2 inhibitors was established. The hits of GuaB2 inhibitors were meaningful to further study.

    Anitubercular agents; Hypoxanthines; Drug evaluation, preclinical

    XIAO Chun-ling, Email: xiaocl318@163.com

    10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2011.06.011

    國家“重大傳染病防治”科技重大專項(2008ZX10003-006)

    100050 北京,中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所重點室

    肖春玲,Email:xiaocl318@163.com

    2011-09-28

    方法以結(jié)核分枝桿菌 H37Rv 基因組為模板,pBEV 表達(dá)質(zhì)粒為載體,將 guaB2 基因克隆至 pBEV 以構(gòu)建pBEV::guaB2 重組表達(dá)質(zhì)粒,表達(dá)并純化重組的結(jié)核分枝桿菌次黃嘌呤單核苷酸脫氫酶;建立以測定反應(yīng)體系 340 nm吸光值變化速率來評價該酶活性的檢定方法;構(gòu)建次黃嘌呤單核苷酸脫氫酶抑制劑的高通量篩選模型,對該模型的可靠性進(jìn)行評價并應(yīng)用該模型對 1765 個化合物進(jìn)行篩選。

    結(jié)果成功構(gòu)建了結(jié)核分枝桿菌 guaB2 基因的表達(dá)載體;最佳反應(yīng)條件下重組結(jié)核分枝桿菌次黃嘌呤單核苷酸脫氫酶酶比活力為 736 U/mg;所建立的高通量篩選模型 Z’ 因子為 0.68,可用于次黃嘌呤單核苷酸脫氫酶抑制劑篩選;應(yīng)用此模型對 1765 個化合物樣品進(jìn)行篩選,得到 5 個具有酶抑制活性的樣品,陽性率為 0.28%。

    結(jié)論建立了穩(wěn)定性好、靈敏度較高的結(jié)核分枝桿菌次黃嘌呤單核苷酸脫氫酶抑制劑高通量藥物篩選模型,應(yīng)用該模型篩選得到的陽性藥物具有進(jìn)一步深入研究的意義。

    Author Affiliation:State-Key Laboratory for Drug Screening, Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100050, China

    www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2011, 6(6):445-449

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