環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在流感病毒檢測(cè)中的應(yīng)用

劉娟，姜濤，秦鄂德，秦成峰

·生物診斷技術(shù)·

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在流感病毒檢測(cè)中的應(yīng)用

劉娟，姜濤，秦鄂德，秦成峰

流感病毒是引起人類流感的病原體之一，屬于正黏病毒科，分為甲型、乙型和丙型流感病毒，其中甲型和乙型流感病毒對(duì)人類具有流行病學(xué)意義。流感病毒感染可導(dǎo)致一系列呼吸道疾病，臨床癥狀從輕微的上呼吸道癥狀至急性呼吸窘迫綜合征和多器官功能衰竭，甚至死亡[1]。流感大流行傳播迅速，波及范圍廣，發(fā)病率和死亡率高，嚴(yán)重威脅著人類健康。1918 年的 H1N1“西班牙流感”、1957 年 H2N2“亞洲流感”和 1968 年 H3N2“香港流感”三次流感大流行導(dǎo)致全球超過(guò) 5000 萬(wàn)人死亡。最近暴發(fā)的 2009 年新甲型H1N1 流感大流行，全球估計(jì)有數(shù)億人感染，約 2 萬(wàn)確診死亡病例[2]。因此流感病毒的早期快速檢測(cè)技術(shù)對(duì)于流感的防控及治療具有重要的意義。

2000 年，Notomi 等[3]建立了一種新型的快速核酸擴(kuò)增方法——環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）。近些年 LAMP 方法逐漸受到關(guān)注，其在病毒性疾病診斷中得到了廣泛的應(yīng)用[4]。本文特針對(duì)該技術(shù)在流感病毒檢測(cè)中的應(yīng)用和前景作一綜述。

1 流感病毒的檢測(cè)方法

流感病毒的早期快速檢測(cè)對(duì)流感的防控非常重要，不僅可縮小呼吸道疾病的傳播范圍及風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)也為臨床呼吸道疾病病原診斷及用藥提供可靠的依據(jù)。目前流感病毒的檢測(cè)技術(shù)主要包括病毒分離、血清學(xué)檢測(cè)、病毒抗原檢測(cè)和核酸檢測(cè)。臨床早期診斷較為常用的快速檢測(cè)方法主要包括免疫層析法和病毒核酸檢測(cè)技術(shù)[5]。免疫層析法是近年來(lái)發(fā)展的一種快速診斷技術(shù)。該技術(shù)利用免疫膠體金或免疫酶染色可使特定區(qū)域顯示一定的顏色，從而實(shí)現(xiàn)特異性的快速免疫診斷。這類方法目前存在的主要問(wèn)題是靈敏度較低[6]。目前流感病毒早期快速檢測(cè)最主要的手段仍然是核酸檢測(cè)方法，主要包括逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）和實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 技術(shù)，但常規(guī) PCR 技術(shù)需要電泳判讀結(jié)果，易造成環(huán)境污染；實(shí)時(shí)技術(shù)則需要較昂貴的儀器，這些限制了該項(xiàng)技術(shù)在流感病毒檢測(cè)中的廣泛應(yīng)用。

2 LAMP 技術(shù)的原理

LAMP 法是一種新型的核酸擴(kuò)增技術(shù)，與傳統(tǒng)的核酸檢測(cè)方法相比，具有靈敏性及特異性高、簡(jiǎn)便快速易于判斷等多種優(yōu)點(diǎn)。LAMP 反應(yīng)是在具有鏈置換活性的BstDNA聚合酶作用下，利用能識(shí)別目的基因上 6 個(gè)獨(dú)立區(qū)段的4 條引物（圖1），即正向內(nèi)側(cè)引物（orward inner primer， FIP）、正向外側(cè)引物（forward outer primer，F(xiàn)3）、反向內(nèi)側(cè)引物（backward inner primer，BIP）、反向外側(cè)引物（backward inner primer，B3），在 60 ～ 65 ℃ 恒溫條件下高效特異地?cái)U(kuò)增目的基因，普通恒溫裝置例如水浴鍋中即可完成，不需要特殊的儀器，60 min 內(nèi)即可完成實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)中亦可添加靶向 F1 與 F2 或 B1 與 B2 區(qū)域間的 1 ～ 2 條環(huán)引物（loop primer），以提高擴(kuò)增反應(yīng)速度。

反應(yīng)終產(chǎn)物是同一條鏈互補(bǔ)序列周而復(fù)始形成的大小不一啞鈴狀 DNA，LAMP 法在高效擴(kuò)增過(guò)程中，一般至少可生成 10 μg/25 μl 產(chǎn)物，同時(shí)產(chǎn)生大量焦磷酸根離子，其與金屬離子形成不可溶的鹽，生成肉眼可見(jiàn)的白色焦磷酸鹽沉淀，因此可直觀觀察擴(kuò)增結(jié)果[7]。在反應(yīng)體系中加入熒光染色試劑，可在紫外光或直接在日光下觀察顏色變化，無(wú)需電泳或特殊儀器。

圖1 LAMP 引物設(shè)計(jì)示意圖[5]

3 LAMP 在流感病毒檢測(cè)中的應(yīng)用

流感檢測(cè)方法的臨床意義主要取決于其快速性。LAMP方法是一種快速簡(jiǎn)便易行的檢測(cè)方法。近些年來(lái)已建立了多種針對(duì)季節(jié)性流感病毒、禽流感病毒和豬流感病毒 LAMP快速檢測(cè)方法（表 1）。這些方法多以 HA 或 M 基因作為靶基因，HA 是流感病毒重要的表面抗原蛋白，是分型的重要依據(jù)，因此多用于設(shè)計(jì)區(qū)分不同亞型的 LAMP 方法。M蛋白相對(duì)保守，主要用于設(shè)計(jì)同時(shí)檢測(cè)多種亞型流感病毒的通用 LAMP 法。

Ito 等[8]針對(duì)季節(jié)性流感病毒 H1 和 H3 亞型的 HA基因以及乙型流感病毒 NP 基因，建立了區(qū)分人季節(jié)性甲型 H1、H3 亞型和乙型流感的 LAMP 檢測(cè)方法。該方法檢測(cè) H3 亞型流感病毒的靈敏性高達(dá) 10 FFU/ml（約為1.5 FFU/反應(yīng)），且僅需 1 h 反應(yīng)時(shí)間；特異性良好，采用不同時(shí)間不同地點(diǎn)分離的不同亞型流感病毒進(jìn)行評(píng)估，均未觀察到交叉擴(kuò)增現(xiàn)象。臨床樣本進(jìn)行驗(yàn)證過(guò)程中 RT-LAMP法優(yōu)于商業(yè)免疫層析試劑盒。隨后，Poon 等[9]建立了基于流感病毒基質(zhì)蛋白 M 基因的 LAMP 方法，可同時(shí)檢測(cè)季節(jié)性 H1、H2 和 H3 亞型，靈敏性高達(dá) 0.001 PFU/反應(yīng)，特異性也非常理想。臨床標(biāo)本評(píng)估的結(jié)果顯示該方法與乙型流感病毒以及其他臨床呼吸道傳染病的常見(jiàn)病原體例均無(wú)交叉反應(yīng)。

禽流感病毒屬于一種人畜共患的流感病毒，有報(bào)道指出在北美和歐洲 15％ 的鴨及超過(guò) 2.8％ 野鳥(niǎo)中均可分離到禽流感病毒[10]。近些年來(lái)，東南亞等地屢次出現(xiàn)高致病性禽流感人感染病例的報(bào)道，提示應(yīng)引起足夠的重視。Jayawardena 等[11]建立的高致病性禽流感 H5N1 特異LAMP 技術(shù)，對(duì)近十年間人和禽的 H5N1 流感病毒均有理想的檢測(cè)效果，其靈敏度高達(dá) 0.002 PFU/反應(yīng)。另一研究所建立的 H5N1 特異 LAMP 方法也具有非常理想的靈敏度，是普通 RT-PCR 的 100 ～ 1000 倍[12]。此外，特異檢測(cè)禽流感病毒 H9 亞型的 LAMP 法也相應(yīng)建立，靈敏性也高達(dá) 10 拷貝/反應(yīng)，較普通 RT-PCR 方法高 10 倍；采用 112份鴨禽病例進(jìn)行評(píng)估，RT-LAMP 法得到的結(jié)果與病毒分離完全一致[13]。H3 亞型禽流感病毒也是重要的一類禽流感，有通過(guò)基因重組直接感染人類的巨大風(fēng)險(xiǎn)[14-15]。Peng 等[16]建立的針對(duì) H3 亞型禽流感病毒 HA 基因的 RT-LAMP法可檢測(cè)到最低 1 pg/反應(yīng)的病毒 RNA，且結(jié)果可通過(guò)顏色變化進(jìn)行野外樣本的檢測(cè)。我國(guó)初亞男等[17]針對(duì)禽流感病毒 M 基因上保守序列設(shè)計(jì)禽流感病毒通用的 LAMP檢測(cè)方法，靈敏度可達(dá) 10 拷貝/反應(yīng)，并可進(jìn)一步通過(guò)擴(kuò)增禽流感病毒（H5N1、H7N7 和 H9N2）3 種亞型特異 HA基因進(jìn)一步鑒定病毒亞型。

豬是流感自然循環(huán)中重要的環(huán)節(jié)，人和禽流感均可感染豬，豬流感病毒亦被證實(shí)可感染人類[18]，因此三種流感病毒在豬體內(nèi)發(fā)生病毒重配/重組的風(fēng)險(xiǎn)很大。2009 年流行的新型 H1N1 流感病毒與豬流感病毒也密切相關(guān)。目前已建立了針對(duì) H3 亞型豬流感病毒的 LAMP 檢測(cè)方法，檢測(cè)靈敏度為 1 PFU/反應(yīng)，是普通 RT-PCR 法靈敏度的 10 倍[19]。2009 年甲型 H1N1 流感大流行暴發(fā)后，相應(yīng)的 LAMP 檢測(cè)方法也迅速建立，檢測(cè)靈敏度為 10 ～ 20 拷貝/反應(yīng)，與實(shí)時(shí) RT-PCR 靈敏度相同[20-21]。

表1 流感病毒 LAMP 檢測(cè)方法

4 RT-LAMP 法的優(yōu)勢(shì)與不足

簡(jiǎn)便快速的 RT-LAMP 方法為缺少儀器和條件的基層醫(yī)療和檢疫單位的流感防疫提供重要手段。已有針對(duì)禽流感病毒 H5、H7 亞型的商業(yè)化 RT-LAMP 檢測(cè)試劑盒在流感病毒的檢測(cè)方面得到了初步應(yīng)用。與目前臨床和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)所應(yīng)用的檢測(cè)方法相比，RT-LAMP 法具有一些特有的優(yōu)勢(shì)：如不需要昂貴的設(shè)備，適合現(xiàn)場(chǎng)和野外使用；判讀也僅需通過(guò)肉眼在日光下即可直觀地判斷結(jié)果，當(dāng)在擴(kuò)增管內(nèi)加入染色劑（如 SYBR Green I[22]、鈣黃綠素[6]和羥基萘酚藍(lán)[20]等）時(shí)，陽(yáng)性擴(kuò)增管相對(duì)陰性會(huì)發(fā)生顏色變化（日光下）和呈現(xiàn)熒光（紫外光下），更易于判讀。這些優(yōu)勢(shì)使得RT-LAMP 法可快速便捷地應(yīng)用于各種環(huán)境中，尤其適用于基層衛(wèi)生醫(yī)療機(jī)構(gòu)。在靈敏度上，RT-LAMP 的靈敏度一般也與實(shí)時(shí) RT-PCR 法相當(dāng)，高于普通 RT-PCR 法靈敏度10 ～ 100 倍，可滿足臨床檢測(cè)的需要。

LAMP 法也存在一些不足。例如，該技術(shù)的引物設(shè)計(jì)要求同時(shí)識(shí)別 6 個(gè)部位的 4 種引物，在實(shí)際應(yīng)用中引物設(shè)計(jì)較為困難，特別是針對(duì)不同亞型流感病毒以及病毒科屬的通用引物；另一方面，也易導(dǎo)致其靈敏度在檢測(cè)不同病毒株時(shí)存在較大差異，因此其應(yīng)用還需進(jìn)一步的評(píng)估和改進(jìn)[23]。其次，該技術(shù)以非特異性的焦磷酸鹽沉淀或熒光變化判讀結(jié)果，因此難以實(shí)現(xiàn)高通量的多重檢測(cè)。

5 展望

目前，RT-LAMP 法在流感病毒檢測(cè)上的應(yīng)用還較為有限。這一新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，具有擴(kuò)增高效快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高、步驟簡(jiǎn)單、鑒定簡(jiǎn)便、不需要昂貴儀器等優(yōu)點(diǎn)，在流感病毒的臨床檢測(cè)技術(shù)上具有很好的應(yīng)用前景，不僅可用于流感病毒的檢測(cè)，還可以檢測(cè)流感病毒耐藥性基因，對(duì)于臨床診斷用藥和流感流行的監(jiān)控具有重要的意義。

從目前流感臨床快速檢測(cè)的實(shí)際需求出發(fā)，研制核酸的快速抽提技術(shù)與 LAMP 方法相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)從樣本處理/核酸制備到 LAMP 擴(kuò)增的系統(tǒng)快速檢測(cè)；同時(shí)改進(jìn)和完善LAMP 檢測(cè)方法，提高其檢測(cè)靈敏度的穩(wěn)定性，并適應(yīng)和滿足當(dāng)前流感多亞型、高通量以及耐藥性和抗原突變等多種檢測(cè)需求，將是未來(lái)一段時(shí)間重要的發(fā)展方向。

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2011-09-30