Folin-Ciocalteu比色法測定枳椇果梗多酚含量

向進樂，李志西，郭香鳳，李 歡，鄭淑彥

(1.西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100；2.河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471003)

Folin-Ciocalteu比色法測定枳椇果梗多酚含量

向進樂1,2，李志西1,*，郭香鳳2，李 歡1，鄭淑彥1

(1.西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100；2.河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471003)

以沒食子酸為標樣，研究Folin-Ciocalteu比色法測定枳椇果?？偡雍康倪m宜條件。結(jié)果表明，枳椇果梗提取物加Folin-Ciocalteu試劑0.6mL、20g/100mL Na2CO3溶液1.5mL，定容至10mL，30℃避光反應(yīng)60min，測定反應(yīng)體系在750nm處的吸光度，多酚質(zhì)量濃度在0～8.47mg/L范圍內(nèi)與吸光度有良好的線性關(guān)系。該方法的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、精密度以及加標回收率的相對標準偏差均符合要求，可用于枳椇果梗多酚含量的測定。

Folin-Ciocalteu法；枳椇果梗；多酚

枳椇為鼠李科枳椇屬(Hovenia thunb)植物，又稱拐棗、雞柤子、半甜夜。全世界有三個種，兩個變種。我國除東北三省、內(nèi)蒙古、新疆、寧夏、青海和臺灣外，其余各省區(qū)均有分布。枳椇屬植物始載于《唐本草》，以果實、木汁、木皮入藥，現(xiàn)由《中國人民共和國衛(wèi)生部藥品標準·中藥材》收載[1]。枳椇屬植物多以枳椇子入藥，即枳椇干燥成熟的種子，關(guān)于枳椇子生物活性成分和生理功能及其作用機制等方面已有諸多報道[1-2]。而關(guān)于肉質(zhì)肥大扭曲、酸甜的枳椇果梗的研究開發(fā)鮮見報道，這可能與其個體小、外形扭曲、殘渣多、適口性差有關(guān)。

目前，國內(nèi)報道的枳椇果梗初級加工制品有枳椇果汁飲料[3-6]、果酒[7]、果醋[8]和酸乳[9]等產(chǎn)品。本課題組[10]以枳椇果梗為原料，采用液態(tài)深層發(fā)酵法釀制出風味獨特的枳椇果梗酒、果醋，并對枳椇醋的保健功能進行初步研究。發(fā)現(xiàn)枳椇醋具有較強的體外抗氧化作用、良好的減肥降脂作用，對急性酒精中毒以及由酒精引起的慢性肝損傷也有很好的預(yù)防作用。鄒禮根等[11]也發(fā)現(xiàn)枳椇果梗水提物具有一定的解酒效果。

對枳椇果梗的化學成分研究也有少量報道。符樹根[3]、江慶中[4]等對枳椇果梗和種子質(zhì)量所占比例和基本化學組成進行研究，枳椇果梗約占總質(zhì)量的90%，兩者基本化學組成差異很大。鮮果梗中含有大量糖分、有機酸、氨基酸和維生素等，其中總糖含量35.13%、還原糖17.23%、總酸390mg/100g、VC 44mg/100g。賈春曉等[12]通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatographymass spectrometry，GC-MS)對枳椇果梗中有機酸進行分析，鑒定出19種有機酸，其中蘋果酸的含量最高，占22.88%；枳椇果梗還含有多種不飽和高級脂肪酸，其中亞麻酸和亞油酸含量分別為5.06%和3.35%。朱炯波等[13]采用蒽酮硫酸比色法對枳椇果梗多糖含量進行分析，枳椇果梗中多糖為13.83%。Yoo等[14]以枳椇果實為原料通過水提、有機溶劑萃取和低壓制備色譜技術(shù)分離制備出高純度的二氫楊梅素。

多酚是植物原料的一種重要次生代謝產(chǎn)物，是絕大多數(shù)植物性食品和藥材的活性成分。枳椇果中含有二氫楊梅素等酚類物質(zhì)[14-15]，但枳椇果梗多酚含量測定的方法尚未見報道。植物多酚含量測定方法較多，包括滴定法、比色法等[16]。Folin-Ciocalteu比色法是Folin-Denis的改進，是目前測定植物多酚含量的最常用方法，但目前報道的不同原料多酚含量測定條件，如檢測波長、Folin-Ciocalteu試劑用量、堿液加入量以及顯色溫度和時間等都有較大差異[16-17]。本研究擬建立Folin-Ciocalteu法測定枳椇果梗多酚含量的適宜條件，以期為枳椇果的進一步研究開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枳椇果 采自西安市臨潼區(qū)龍河西岸南姚村；沒食子酸(純度≥98%) 成都曼斯特生物科技有限公司；Folin-Ciocalteu試劑 上海荔達生物科技有限公司；甲醇、Na2CO3等常規(guī)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2550雙光束紫外分光光度計、UVmini 1240單孔紫外分光光度計 日本島津公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；KH5200B超聲清洗機 昆山禾創(chuàng)超聲設(shè)備有限公司；電子天平 北京塞多利斯天平有限公司；電熱恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司；移液器上海大龍醫(yī)療設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 對照品溶液與樣品溶液的制備

對照品溶液配制：精密稱取沒食子酸對照品12.1mg加甲醇溶解定容至100mL，得質(zhì)量濃度121mg/L沒食子酸標準溶液。

枳椇果梗多酚溶液的制備：參考呂群金等[18]的方法略有改動。稱取干燥的枳椇果梗粉末1.0g加入40mL 70%甲醇溶液，40℃超聲提取30min，過濾得濾液。濾渣加入30mL 70%甲醇溶液重復提取2次，合并濾液，減壓濃縮定容至25mL作為枳椇果梗多酚樣品溶液。

1.3.2 Folin-Ciocalteu法比色條件的選擇

1.3.2.1 檢測波長的選取[16]

取沒食子酸標準溶液和枳椇果梗樣品溶液各0.1mL，分別加蒸餾水稀釋，加0.5mL Folin-Ciocalteu試劑混勻，3min后加入1.5mL 20g/100mL Na2CO3溶液，加水定容至10mL，室溫避光反應(yīng)120min，以空白為對照，在500～900nm范圍內(nèi)掃描確定最大吸收波長。

1.3.2.2 顯色溫度和時間的確定[17]

分別取對照品溶液和枳椇果梗樣品溶液0.25mL于25mL容量瓶中，加水稀釋，加入Folin-Ciocalteu試劑1.25mL混勻，3min后加入20g/100mL Na2CO3溶液3.75mL，加水定容，將各比色試劑混合均勻后，分別于25、30、35、40、45℃條件下水浴避光反應(yīng)，分別于30、60、90、120、150min時測定吸光度，以考察反應(yīng)溫度和顯色時間對顯色效果的影響。

1.3.2.3 Folin-Ciocalteu試劑和Na2CO3溶液加入量[17]

取枳椇果梗樣品溶液0.1mL，加水稀釋，分別加入0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mL Folin-Ciocalteu試劑混勻，3min后加入20g/100mL Na2CO3溶液1.5mL，30℃避光反應(yīng)60min，考察Folin-Ciocalteu試劑用量對吸光度的影響。

取枳椇果梗樣品溶液0.1mL，加水稀釋，分別加入0.6mL的Folin-Ciocalteu試劑混勻，3min后按1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3、1∶3.5的比例加入20g/100mL Na2CO3溶液，30℃避光反應(yīng)60min，考察Folin-Ciocalteu試劑與Na2CO3溶液比例對吸光度的影響。

1.3.3 標準曲線的繪制[16]

精密吸取1、2、3、4、5、6、7mL沒食子酸標準溶液，加水稀釋定容于10mL棕色容量瓶得不同質(zhì)量濃度的標準溶液。分別取1mL不同濃度的對照品溶液加水稀釋，加入0.6mL Folin-Ciocalteu試劑混勻，3min后加入20g/100mL Na2CO3溶液1.5mL，30℃避光反應(yīng)60min，以蒸餾水代替樣品為空白，在750nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，沒食子酸溶液質(zhì)量濃度為橫坐標繪制標準曲線。枳椇果梗多酚含量以沒食子酸標準品計。

1.3.4 Folin-Ciocalteu法測定枳椇果梗多酚的方法學評價[16]

穩(wěn)定性實驗：取同一枳椇果梗樣品溶液按確定的測定條件，分別在樣品液與顯色劑反應(yīng)60、90、120、150、180、210min后的不同時間內(nèi)測定吸光度，以評價該方法在一段時間內(nèi)的穩(wěn)定性。

重現(xiàn)性實驗：取干燥的枳椇果梗粉末樣品5份，依上述樣品溶液制備和分析方法，計算結(jié)果的相對標準偏差，以評價該方法的重現(xiàn)性。

精密度實驗：采用確定的測定方法對同一枳椇果梗提取液測定5次，計算結(jié)果的相對標準偏差，以評價該方法的精密度。

加標回收實驗：取已知多酚含量的枳椇果梗樣品5份，分別加入不同量的沒食子酸標準物質(zhì)，分別測定混合樣品顯色后的吸光度，計算其回收率和相對標準偏差，以評價該方法的準確度和可靠性。

2 結(jié)果與分析

2.1 Folin-Ciocalteu法檢測條件的確定

2.1.1 檢測波長的確定

多酚物質(zhì)與Folin-Ciocalteu試劑反應(yīng)顯色是基于Folin-Ciocalteu試劑中的鎢鉬酸將多酚化合物定量氧化，自身被還原(使W6+變?yōu)閃5+)生成藍色的化合物，在680～780nm有較大吸收[16-22]。沒食子酸對照品、枳椇果梗提取物與Folin-Ciocalteu顯色后的光譜圖如圖1所示，兩者均在750nm左右有最大吸收，故選750nm為檢測波長。

圖1 沒食子酸對照品(a)和枳椇果梗提取物(b)顯色后的光譜圖Fig.1 Visible absorption spectra of Folin-Ciocalteu reagent in the presence of gallic acid (a) or of Hovenia acerba fruit extract (b)

2.1.2 顯色溫度和時間的確定

圖2 沒食子酸對照品不同顯色溫度和時間的吸光度Fig.2 Absorbance of reaction products between gallic acid and Folin-Ciocalteu reagent at different reaction time points and temperatures

多酚物質(zhì)與Folin-Ciocalteu試劑反應(yīng)需要一定溫度和反應(yīng)時間才能顯色完全。從圖2可知，沒食子酸標準溶液在不同溫度條件下顯色，達到最大吸光度的時間有較大差異。溫度越高達到最大吸光度的時間越短。35～45℃時，顯色30min吸光度就達到最大，30min后吸光度下降明顯。說明溫度高能加快顯色進程，但是顯色體系的穩(wěn)定性較差。25～30℃顯色，反應(yīng)30min吸光度達到較大值，隨著反應(yīng)時間的延長吸光度增加，60～120min達到最大值，顯色體系穩(wěn)定性很好。但在25℃，吸光度偏低，反應(yīng)時間長。

圖3 枳椇樣品不同顯色溫度和時間的吸光度Fig.3 Absorbance of reaction products between Hovenia acerba fruit extract and Folin-Ciocalteu reagent at different reaction time points and temperatures

圖3為不同顯色溫度和時間條件下，枳椇果梗樣品溶液顯色后的吸光度的變化?？梢钥闯觯瑴囟鹊?，反應(yīng)慢，吸光度小；溫度高，反應(yīng)快，達到最大吸光度的時間短，但是反應(yīng)體系很不穩(wěn)定，而且，溫度越高，越不穩(wěn)定。30℃時，隨著時間的延長，吸光度升高，在60～120min處于最大值。因此，確定Folin-Ciocalteu法測定枳椇多酚含量的顯色溫度為30℃，顯色時間為60min。

比較圖2、3發(fā)現(xiàn)，枳椇果梗樣品與沒食子酸對照品在不同溫度和時間后顯色結(jié)果有相同的趨勢。故在其他顯色條件的確定中，只以枳椇果梗樣品溶液為研究對象。

2.1.3 Folin-Ciocalteu顯色劑和Na2CO3加入量

圖4 Folin-Ciocalteu試劑加入量對吸光度的影響Fig.4 Effect of Folin-Ciocalteu reagent amount on the absorbance of reaction products at 750 nm

由圖4可以看出，F(xiàn)olin-Ciocalteu試劑用量在0.3～0.6mL內(nèi)，隨著顯色劑用量的增加，測得的吸光度增加，當顯色劑的用量超過0.6mL后，吸光度的變化不明顯。因此，選擇Folin-Ciocalteu試劑加入量為0.6mL。

Folin-Ciocalteu試劑與酚類化合物反應(yīng)的必須在堿性條件下才可以顯色，反應(yīng)體系中Na2CO3溶液是顯色的支持介質(zhì)。Na2CO3溶液與Folin-Ciocalteu試劑的比例會影響體系的顯色效果[17]。由圖5可以看出，當Na2CO3溶液用量增加時，吸光度升高，當Na2CO3溶液與Folin-Ciocalteu試劑比例增加到2.5∶1時，吸光度最大。但進一步增加Na2CO3溶液吸光度反而降低，說明體系中堿液的用量不宜過大?？赡苁菈A性過強，顯色體系不穩(wěn)定造成吸光度的降低。因此，確定Folin-Ciocalteu試劑與20g/100mL的Na2CO3溶液的體積比為1∶2.5。

圖5 Na2CO3與Folin-Ciocalteu的體積倍數(shù)對吸光度的影響Fig.5 Effect of sodium carbonate amount on the absorbance of reaction products at 750 nm

2.1.4 標準曲線的繪制

按照確定的檢測條件繪制標準曲線，得線性回歸方程為y=0.1192χ＋0.011，相關(guān)系數(shù)R2=0.9995。沒食子酸質(zhì)量濃度在0～8.47mg/L范圍內(nèi)，吸光度與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系。

2.2 Folin-Ciocalteu法測定枳椇果梗多酚方法學評價

2.2.1 穩(wěn)定性實驗

同一樣品在不同時間的吸光度見表1，相對標準偏差為0.55%。說明該方法在一定時間內(nèi)穩(wěn)定性較好。

表1 不同時間點測定樣品吸光度Table 1 Stability test for the optimized Folin-Ciocalteu method

2.2.2 重現(xiàn)性實驗

表2 5份樣品測得的多酚含量Table 2 Repeatability test for the optimized Folin-Ciocalteu method

稱取5份枳椇果梗樣品測得多酚含量如表2，相對標準偏差為1.95%。說明該方法的重現(xiàn)性較好。

2.2.3 精密度實驗

同一樣品測定5次，吸光度分別為0.676、0.673、0.657、0.671、0.665。相對標準偏差為1.13%，說明該方法具有較高的精密，能滿足枳椇果梗多酚測定。

2.2.4 加標回收實驗

對Folin-Ciocalteu比色法測定枳椇果梗多酚進行加標回收實驗，見表3。5次加標回收最高回收率為101.9%，最低為96.3%，平均為99.9%，相對標準偏差為2.22%。說明Folin-Ciocalteu法測定枳椇果梗多酚含量具有一定的可靠性。

表3 加標回收實驗Table 3 Spike recovery test for the optimized Folin-Ciocalteu method

3 結(jié)論與討論

Folin-Ciocalteu比色法測定枳椇果梗中總酚含量的適宜條件為枳椇果梗提取液加Folin-Ciocalteu試劑0.6mL、20g/100mL Na2CO3溶液1.5mL，30℃避光反應(yīng)60min后在750nm波長處測定。

Folin-Ciocalteu比色法測定枳椇果梗中總酚在前人研究[17-22]的基礎(chǔ)上有所該改進。該方法縮短了顯色反應(yīng)時間，同時具有操作簡單、穩(wěn)定性好、精密度高、準確可靠等優(yōu)點。Folin-Ciocalteu比色法能夠用于枳椇果梗多酚含量的測定。

枳椇果梗除具有高糖分以及較高的營養(yǎng)價值外，多酚物含量也較高，枳椇果梗具有很好的開發(fā)利用價值。實驗測得多酚含量為1.38%，多酚物質(zhì)可能是枳椇果梗及其加工制品的主要生理活性物質(zhì)之一，本實驗采用HPLC-DAD，通過標準品對照發(fā)現(xiàn)枳椇果梗提取物中含有二氫楊梅素、沒食子酸等酚類物質(zhì)。

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Folin-Ciocalteu colorimetric Determination of Total Polyphenol Content in Hovenia acerba Fruit

XIANG Jin-le1,2，LI Zhi-xi1,*，GUO Xiang-feng2，LI-Huan1，ZHENG Shu-yan1
(1. College of Food Science and Engineering, Northwest A & F University, Yangling 712100, China；2. College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China)

A quantitative Folin-Ciocalteu colorimetry method to determine total polyphenols in Hovenia acerba fruit was developed. The color reaction was carried out with 0.6 mL of Folin-Ciocalteu reagent and 1.5 mL of 20 g/100 mL aqueous Na2CO3 solution in darkness at 30 ℃ for 60 min. The detection wavelength was set as 750 nm. The linear range of the established standard curve was 0-8.47 mg/L. The relative standard deviations of stability, reproducibility, precision, and spike recovery rate of this method were all satisfactory. Thus, this method can be applicable to determine the total polyphenols of Hovenia acerba fruit.

Folin-Ciocalteu colorimetry；Hovenia acerba fruit；polyphenol

TS207.3

A

1002-6630(2011)14-0210-05

2010-10-25

國家級大學生科技創(chuàng)新資助項目(091071202)

向進樂(1980—)，男，講師，博士研究生，主要從事植物活性成分研究。E-mail：xiangjinlexinong@163.com*

李志西(1958—)，男，教授，博士，主要從事發(fā)酵功能食品研究。E-mail：lizhxi@nwsuaf.edu.cn