苦丁茶多酚的提取及抗氧化活性

劉 佳，焦士蓉*，唐遠謀，唐鵬程，馮 慧

(西華大學生物工程學院，四川 成都 610039)

苦丁茶多酚的提取及抗氧化活性

劉 佳，焦士蓉*，唐遠謀，唐鵬程，馮 慧

(西華大學生物工程學院，四川 成都 610039)

對苦丁茶中多酚的提取及抗氧化活性進行研究。通過單因素和響應面試驗可知，在乙醇體積分數(shù)52%、料液比1:24(g/mL)、提取時間62s、微波功率291W條件下可獲得最高的提取量115.40mg/g?？喽〔瓒喾犹崛∫簩PPH自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基的半清除質(zhì)量濃度以及對脂質(zhì)過氧化的半抑制質(zhì)量濃度分別為29.24、34.14、872.3、11.48mg/L。表明苦丁茶多酚具有較強的抗氧化作用。

苦丁茶；多酚；提??；響應面分析法；抗氧化

“苦丁茶”是我國一大類代茶植物或代茶產(chǎn)品的統(tǒng)稱。冬青屬苦丁茶主要產(chǎn)于我國南部及西南部地區(qū)，是民間傳統(tǒng)的藥用植物。據(jù)文獻報道，苦丁茶有防治心腦血管系統(tǒng)疾病、降低血壓、降脂、抗氧化等藥理保健作用[1]，其粗提物均有不同程度的抑菌作用[2]。由苦丁茶冬青葉片制成的苦丁茶是民間常用中草藥，是傳統(tǒng)中成藥“甘和茶”的主要原料之一[3]，含有豐富的黃酮、多酚、三萜類皂甙及金屬元素[4-5]，所含的各種成分的藥理作用及保健功能日益引起人們的關(guān)注[6]，具有廣闊的開發(fā)應用前景[7]。

本實驗采用響應面法，以苦丁茶冬青樹(I l e x KudinchaC.J.Tseng)葉片中的多酚含量作為響應值，對苦丁茶多酚的提取工藝進行探討，旨在得到最優(yōu)工藝條件，并通過幾個方面研究苦丁茶多酚的抗氧化性能，為苦丁茶保健成分的開發(fā)利用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

苦丁茶(市售)粉碎過80目篩；福林-酚試劑 北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；DPPH自由基 美國Sigma公司；2-硫代巴比妥酸 上海科豐化學試劑有限公司；其他常見試劑(分析純) 成都科龍化工試劑廠。

TB-214型電子天平 美國丹佛儀器設(shè)備廠；HH-S型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市金城國勝實驗儀器廠；UV-2600型紫外可見分光光度計(配有玻璃比色皿) 上海尤尼柯儀器有限公司；MP17C-KE家用微波爐 美的集團。

1.2 方法

1.2.1 多酚提取方法

稱取苦丁茶粉樣品2g，采用不同的提取溶劑，分別探究提取時間、料液比、微波功率因素對多酚得率的影響。

1.2.2 多酚提取量測定

采用福林-酚比色法[7-8]，以沒食子酸為標準品，標準曲線y=0.0081x＋0.0286，R2=0.9999，計算公式為：

式中：p為總多酚類物質(zhì)提取量/(mg/g)；c為從回歸方程計算得到樣品中多酚類物質(zhì)質(zhì)量濃度/(μg/mL)；v為苦丁茶溶液的體積/mL；n為稀釋倍數(shù)；m為茶粉質(zhì)量/g。

1.2.3 抗氧化活性的測定

1.2.3.1 對DPPH自由基的清除

按照文獻[9]的方法并做適當修正：稱取2,2-二苯代苦味?；?2,2-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)標準品20mg，無水乙醇定容至500mL，得質(zhì)量濃度0.04mg/mL溶液。取此溶液3mL，加入不同質(zhì)量濃度樣品液1mL，室溫反應30min，于517nm波長處測定吸光度，空白組以1mL無水乙醇代替樣品液，并按下式計算清除率：

1.2.3.2 對羥自由基的清除

按照金鳴等[10]的比色法，0.75mmoL/L的鄰二氮菲溶液1mL，加入pH7.4的磷酸緩沖溶液(PBS)2mL和蒸餾水1mL，充分混勻后，加入0.75mmol/L硫酸亞鐵溶液1mL，然后再加入0.01%過氧化氫1mL，于37℃保持60min，在波長536nm處測吸光度Ap；用1mL乙醇代替1mL過氧化氫，測得吸光度Ab，1mL不同質(zhì)量濃度的樣液代替蒸餾水，測得吸光度As。以下式計算苦丁茶多酚對OH自由基的清除率(H/%)：

1.2.3.4 對脂質(zhì)過氧化的抑制

[12]的方法并做適當改進，小鼠處死后取肝洗凈，剪碎，用生理鹽水制成3%的勻漿。取勻漿0.6mL，加入不同濃度樣液0.34mL，0.0024%過氧化氫0.2mL，0.03mmol/L硫酸亞鐵溶液0.2mL，于37℃水浴保溫60min后，加入2mL 20%三氯乙酸及2mL 0.67% TBA溶液，90℃保溫15min，用水冷卻至室溫，4000r/min離心20min，取上清液，在532nm波長處測得吸光度，以水代替TBA的平行試驗管調(diào)零，以蒸餾水代替料液的反應管為空白管，抑制率(I/%)計算公式為：

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的篩選

圖1 溶劑對苦丁茶多酚提取的影響Fig.1 Effect of solvents on extraction rate of polyphenols from Kuding tea

按照1.2.1節(jié)方法，在提取時間80s、料液比1:20、微波功率291W條件下進行試驗，結(jié)果見圖1。由圖1可知，提取溶劑為丙酮時，苦丁茶多酚提取量最高，乙醇次之；由于丙酮的毒性以及溶劑價格較高的因素，選取乙醇作為提取溶劑。

2.2 單因素試驗

2.2.1 乙醇體積分數(shù)對苦丁茶多酚提取的影響

圖2 乙醇體積分數(shù)對苦丁茶多酚提取的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction rate of polyphenols from Kuding tea

按照2.1節(jié)方法，改變乙醇體積分數(shù)進行試驗，結(jié)果見圖2。由圖2可知，當乙醇體積分數(shù)為50%時，苦丁茶多酚的提取量最高，故乙醇體積分數(shù)選取50%。

2.2.2 料液比對苦丁茶多酚提取的影響

圖3 料液比對苦丁茶多酚提取的影響Fig.3 Effect of material/liquid ratio on extraction rate of polyphenols from Kuding tea

乙醇體積分數(shù)為50%，其他條件同2.2.1節(jié)，改變料液比進行試驗，結(jié)果如圖3。由圖3可知，當料液比1:20 (g/mL)時苦丁茶多酚提取量最高，故選取料液比1:20(g/mL)。

2.2.3 提取時間對苦丁茶多酚提取的影響

圖4 提取時間對苦丁茶多酚提取的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate of polyphenols from Kuding tea

料液比1:20，其他條件同2.2.2節(jié)，改變提取時間進行試驗，結(jié)果見圖4。由圖4可知，當提取時間為60s時，苦丁茶多酚提取量最大，時間過長多酚提取量反而降低，可能是因為時間過長導致部分多酚類物質(zhì)被氧化或分解，故提取時間選取60s。

2.2.4 微波功率對苦丁茶多酚提取的影響

圖5 微波功率對苦丁茶多酚提取的影響Fig.5 Effect of microwave power on extraction rate of polyphenols from Kuding tea

選取提取時間60s，其他條件同2.2.3節(jié)，改變微波功率，結(jié)果見圖5。由圖5可知，微波功率為291W時，苦丁茶多酚提取最高，但隨著微波功率的增大多酚提取量迅速降低，可能是因為功率過大加速了多酚類物質(zhì)的氧化分解或使溶劑大量揮發(fā)，故選取提取功率為291W。

2.3 響應曲面法結(jié)果與分析

響應曲面由法常用于優(yōu)化最佳測試條件[13-14]。由單因素試驗結(jié)果可知，乙醇體積分數(shù)、料液比、提取時間3個因素對苦丁茶多酚提取率的影響較大，故選取這3個因素做Box-Behnken設(shè)計，并且以苦丁茶多酚提取量作為響應值，設(shè)計及結(jié)果見表1。

表1 Box-Behnken設(shè)計試驗因素水平及編碼Table 1 Factors and levels in Box-Behnken design

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Results of Box-Behnken design tests

利用Design Expert軟件對上述結(jié)果進行分析，得到多酚含量(Y)對乙醇體積分數(shù)(A)、料液比(B)、提取時間(C)的二次多項回歸方程：

Y=113.22＋2.50A＋3.92B－2.87C＋1.56AB＋1.02AC＋4.70BC－9.64A2－3.06B2－2.31C2

試驗所選用模型P值為0.0019，極顯著(P＜0.05)，決定系數(shù)R2=0.9741，說明響應值的變化有97.41%來源于所選變量，該方程的擬合情況好。

響應面圖形是響應值對各試驗因素X1、X2、X3所構(gòu)成的三維空間的曲面圖，從響應面分析圖上形象地看出最佳參數(shù)及各參數(shù)之間的相互作用。當特征值均為正值時，響應面分析圖為山谷形曲面，有極小值存在；當特征值為負值時，為山丘曲面，有極大值存在；當特征值有正有負時，為馬鞍形曲面，無極值存在。

圖6 各兩因素交互作用對多酚提取量的響應面圖Fig.6 Response surface plot for the effect of cross-interaction between ethanol conceration, material-liquid ratio and extraction time on the extraction rate of polyphenols from Kuding tea

由圖6A可知，乙醇體積分數(shù)對苦丁茶多酚提取量影響比較大，表現(xiàn)為曲線較陡，料液比對苦丁茶多酚提取量影響不是很大，表現(xiàn)為曲線較為平緩。當乙醇體積分數(shù)在0水平，即50%時，多酚提取量最大，說明過高過或過低的乙醇體積分數(shù)均不適合苦丁茶多酚的提取。由圖6B可知，料液比對苦丁茶多酚提取量影響比較小，而提取時間對苦丁茶多酚提取影響較大，且較短的時間更有利于提取。圖6C進一步說明乙醇體積分數(shù)對苦丁茶多酚提取量影響比較大，曲線較陡。

2.4 驗證實驗

通過輔助軟件Design Expert優(yōu)化提取條件得到多酚提取量最高的超過114.80mg/g的5組數(shù)據(jù)，分析這5組數(shù)據(jù)，得到苦丁茶多酚含量超過114.80mg/g的各參數(shù)的范圍為乙醇體積分數(shù)51%～53%、料液比1:23～1:25(g/mL)、提取時間60～64s。經(jīng)以上分析，再綜合實驗的好操作性，選取乙醇體積分數(shù)52%、料液比1:24、提取時間62s，進行驗證實驗。根據(jù)回歸方程，計算其預測值為114.4832mg/g。進行3次平行實驗，得到平均結(jié)果為115.40mg/g，相對誤差為0.8%，證明響應面優(yōu)化苦丁茶多酚的提取工藝可行。

2.5 抗氧化活性測定

2.5.1 對DPPH自由基的清除

圖7 苦丁茶多酚對DPPH自由基清除作用Fig.7 Scavenging rate of polyphenols from Kuming tea on DPPH free radicals

如圖7所示，由回歸方程得苦丁茶多酚對DPPH自由基的半清除質(zhì)量濃度EC50=29.24mg/L。

2.5.2 對羥自由基的清除

圖8 苦丁茶多酚對羥自由基的清除作用Fig.8 Scavenging rate of polyphenols from Kuming tea on hydroxyl free radicals

由圖8回歸方程可得，苦丁茶多酚對OH自由基的半清除質(zhì)量濃度HC50=34.14mg/L。

圖9 苦丁茶多酚對O2·的清除作用Fig.9 Scavenging rate of polyphenols from Kuming tea on superoxide anion ion free radicals

圖10 苦丁茶多酚對脂質(zhì)過氧化的抑制作用Fig.10 Inhibition rate of polyphenols from Kuming tea on lipid peroxidation

2.5.4 對脂質(zhì)過氧化的抑制由圖10回歸方程計算可得，苦丁茶多酚對脂質(zhì)過氧化的半抑制質(zhì)量濃度IC50=11.48mg/L。

3 結(jié) 論

3.1 通過單因素試驗，確定了苦丁茶多酚提取的最佳工藝條件為乙醇體積分數(shù)50%、料液比1:20(g/mL)、提取時間60s、微波功率291W。

3.2 通過Box-Behnken響應曲面法優(yōu)化，確定苦丁茶多酚提取的最佳試驗條件為乙醇體積分數(shù)52%、料液比

1:24(g/mL)、提取時間62s。以該優(yōu)化條件在微波功率291W時提取苦丁茶多酚含量達到115.40mg/g。

34.14、872.3mg/L，對脂質(zhì)過氧化的半抑制質(zhì)量濃度為11.48mg/L。

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Extraction and Antioxidant Activity of Polyphenols from Kuding Tea

LIU Jia，JIAO Shi-rong*，TANG Yuan-mou，TANG Peng-cheng，F(xiàn)ENG Hui
(School of Bioengineering, Xihua University, Chengdu 610039, China)

The optimal conditions for the extraction of Kuding tea polyphenols for achieving maximum extraction yield were determined by response surface methodology to be ethanol concentration of 52%, material/liquid ratio of 1:24 (g/mL), microwave power of 291 W, and microwave treatment time of 62 s. The extraction rate of polyphenols was 114.82 mg/g under the optimal extraction conditions. The IC50 values of the obtained extract against DPPH, hydroxyl, superoxide anion ion free radicals and lipid peroxidation were 29.24, 34.14, 872.3 mg/L and 11.48 mg/L, respectively, suggesting that Kuding tea polyphenols have a remarkable antioxidant effect.

Kuding tea；polyphenols；extraction；response surface analysis；antioxidant

TS272.2；TS272.5

A

1002-6630(2011)14-0134-05

2010-09-19

四川省教育廳自然科學重點項目(09ZA158)；西華大學2008校人才培養(yǎng)與引進科研項目(R0920501)

劉佳(1987—)，女，碩士研究生，研究方向為食品營養(yǎng)與安全。E-mail：liujia13568864205@163.com

*通信作者：焦士蓉(1968—)，女，教授，博士，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：jsrong2004@163.com