宣木瓜多酚氧化酶酶學(xué)特性與抑制劑研究

張國(guó)慶，董 明，李 娜，俞雅瓊，王旭東

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽 合肥 230036)

宣木瓜多酚氧化酶酶學(xué)特性與抑制劑研究

張國(guó)慶，董 明*，李 娜，俞雅瓊，王旭東

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽 合肥 230036)

研究宣木瓜不同部位的多酚氧化酶(PPO)的活性及其溫度、pH值、底物專一性等特性和抑制方法。結(jié)果表明：果心中的PPO活性明顯高于果皮和果肉，宣木瓜組織的褐變主要是由多酚氧化酶引起；PPO最適底物為鄰苯二酚；最適溫度20℃，在80℃處理5min即可鈍化PPO的活性；最適pH5.5，在酸性條件下穩(wěn)定性優(yōu)于堿性；抗壞血酸、L-半胱氨酸、亞硫酸氫鈉、檸檬酸和氯化鈉均能有效的抑制PPO的活性。

宣木瓜；多酚氧化酶；特性；抑制劑

宣木瓜(Chaenomeles speciosa S. Nakai)，屬薔薇科貼梗海棠，是我國(guó)著名的四大“藥食同源”植物之一，為安徽省著名地道果實(shí)，在我國(guó)四川、湖北和安徽等地均有種植，但以宣城產(chǎn)品質(zhì)為最優(yōu)[1]。宣木瓜中富含有齊墩果酸、熊果酸等有機(jī)酸、氨基酸、皂苷、維生素、黃酮類以及鉀、鈣、鎂、鋅、鐵等多種微量元素和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有極高的食用價(jià)值和保健作用[2-3]。但宣木瓜在生產(chǎn)加工過(guò)程中極易發(fā)生褐變，嚴(yán)重的影響了產(chǎn)品的感官品質(zhì)和食用價(jià)值。

多酚氧化酶(Polyphenol oχidase，PPO，E.C.1.10.3.1)是廣泛存在于植物中的一類含銅氧化還原酶，與酶促褐變的發(fā)生密切相關(guān)，是引起酶促褐變的3大條件之一[4]。雖然國(guó)內(nèi)外關(guān)于果蔬多酚氧化酶性質(zhì)和控制的報(bào)道很多，但是不同果蔬的褐變及其機(jī)理都有所不同[5-13]。目前，宣木瓜的研究主要在中藥材、果酒、果脯以及有效成分的提取和利用，但是關(guān)于多酚氧化酶的特性及抑制劑的研究至今尚未有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究宣木瓜的PPO在不同環(huán)境體系中的活力變化，探索宣木瓜酶促褐變的機(jī)理，以期為控制宣木瓜貯藏和加工中酶促褐變的發(fā)生、篩選經(jīng)濟(jì)有效的褐變抑制劑提供理論基礎(chǔ)和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

宣木瓜：2009年7月中旬采自安徽宣城新田鎮(zhèn)宣木瓜基地，經(jīng)挑選、整理，用聚乙烯保鮮袋盛放，置于2～4℃冷庫(kù)中貯藏備用。鄰苯二酚、焦性沒(méi)食子酸、愈創(chuàng)木酚、綠原酸、苯酚、沒(méi)食子酸、抗壞血酸、L-半胱氨酸、NaHSO3、檸檬酸、NaCl等均為分析純。

DK-S24型電熱恒溫水浴鍋 上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司；UV-1800型紫外-可見分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；TGL-16M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)有限公司；ZK型組合式冷庫(kù) 常州銀雪制冷設(shè)備有限公司；LA114型電子天平 常州市衡器廠。

1.2 方法

1.2.1 宣木瓜PPO粗酶液的制備[14]

取預(yù)冷的無(wú)病蟲害、無(wú)機(jī)械傷的宣木瓜，經(jīng)過(guò)去皮、去核后，稱取20g宣木瓜果肉，置于研缽中，按1:1.5(g/mL)的比例加入預(yù)冷的pH5.5提取緩沖液(含1mmol PEG、4% PVPP和1% Triton X-100)，冰浴條件下研磨成勻漿，放入4℃冰箱中提取20min，取出后用紗布過(guò)濾，4℃、8000r/min離心20min，所得上清液即為多酚氧化酶粗酶液。4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PPO活性的測(cè)定

根據(jù)參考文獻(xiàn)[15]方法，略作修改。取1.9mL 0.05mol/L、pH5.5乙酸-乙酸鈉緩沖液和1.0mL 0.05mol/L鄰苯二酚溶液，最后加入0.5mL酶提取液，混勻后立即測(cè)定反應(yīng)體系在420nm處吸光度。以蒸餾水為參照，每隔30s記錄一次，共記錄2min。酶活性定義為：每克果肉1min內(nèi)吸光度(A420)增加0.001為1個(gè)活力單位(U)。酶的相對(duì)活性計(jì)算：在測(cè)定條件下，以酶的活性的最高值作為100%。

1.2.3 褐變強(qiáng)度的測(cè)定

新鮮樣品按1:5(g/mL)加蒸餾水，低溫下勻漿、過(guò)濾，濾液放置25℃水浴中保溫5min，于420nm測(cè)定吸光度，褐變強(qiáng)度以A420表示。

1.2.4 PPO的活性

按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)，調(diào)節(jié)反應(yīng)的pH值和溫度，再加入酶液和鄰苯二酚溶液，測(cè)定不同條件和反應(yīng)體系下宣木瓜多酚氧化酶的活性。

1.2.5 抑制劑對(duì)PPO酶活的影響

分別向反應(yīng)體系中加入0.5mL不同濃度的抑制劑，再加入鄰苯二酚溶液，測(cè)定反應(yīng)體系中殘余宣木瓜PPO的活性。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)測(cè)定平行兩次，分別平均取樣，結(jié)果取平均值計(jì)算，所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用Microsoft Excel 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 宣木瓜PPO反應(yīng)進(jìn)程曲線的測(cè)定

圖1 宣木瓜PPO活力曲線Fig.1 Enzymatic reaction curve of PPO from C. speciosa fruit

由圖1可見，宣木瓜中的PPO 反應(yīng)速度在2min內(nèi)幾乎呈直線上升，隨后反應(yīng)速度逐漸變緩。為了正確測(cè)定酶促反應(yīng)速度而避免各種因素的干擾，應(yīng)該測(cè)定酶促反應(yīng)的初速度。因此，研究酶活應(yīng)首先以直線部分來(lái)確定測(cè)定時(shí)間，本試驗(yàn)在2min 內(nèi)測(cè)定酶的活性有實(shí)際意義。

2.2 底物濃度對(duì)PPO活性的影響

圖2 底物濃度與酶活的關(guān)系Fig.2 Effect of catechol concentration on the PPO activity

以不同濃度鄰苯二酚溶液為底物，研究底物濃度對(duì)PPO活性的影響。由圖2可看出，當(dāng)?shù)孜餄舛刃∮?.05mol/L時(shí)，酶活幾乎成直線上升，隨后隨著濃度的增大，酶活不但沒(méi)有上升反而有下降的趨勢(shì)，可能是因?yàn)榉磻?yīng)產(chǎn)物的積累抑制了酶活。當(dāng)濃度達(dá)到0.05mol/L時(shí)，酶的活性最大，所以本實(shí)驗(yàn)選擇0.05mol/L的鄰苯二酚溶液作為底物濃度。

2.3 宣木瓜不同部位的PPO活性和褐變程度

分別切取宣木瓜果皮、果肉和果心，按照1.2節(jié)方法提取測(cè)定PPO活性和褐變強(qiáng)度。測(cè)定結(jié)果見表1。

表1 宣木瓜不同部位PPO活性及褐變強(qiáng)度Table1 PPO activities in different part of C. speciosa fruit

表1數(shù)據(jù)表明，宣木瓜果心組織中的PPO活性均高于果皮和果肉，其中是果皮的4.12倍，是果肉的2.46倍；果心的褐變程度也明顯高于其他組織，分別是果皮的1.70倍，果肉的1.34倍。

圖3 褐變強(qiáng)度與PPO活性相關(guān)性分析Fig.3 Correlation analysis between PPO activity and browning degree

對(duì)宣木瓜各部位的PPO活性和褐變強(qiáng)度數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸，得到一條直線，R2值為0.9719，可知宣木瓜組織中的PPO和褐變度呈顯著正相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)r=0.9859。這說(shuō)明宣木瓜的褐變主要是由多酚氧化酶引起的。果心的褐變高于其他部位，主要是由于其中的多酚氧化酶活性較高。在宣木瓜生產(chǎn)加工過(guò)程中，應(yīng)盡量去盡果心和果皮，以免影響產(chǎn)品的感官品質(zhì)。

2.4 底物專一性

表2 不同底物對(duì)酶活的影響Table2 Effect of substrate on the activity of PPO from C. speciosa fruit

分別以0.05mol/L 鄰苯二酚、焦性沒(méi)食子酸、綠原酸、沒(méi)食子酸、苯酚和愈創(chuàng)木酚為底物，測(cè)定宣木瓜PPO在不同底物條件下的活性。結(jié)果表明，鄰苯二酚、焦性沒(méi)食子酸、綠原酸、沒(méi)食子酸都對(duì)PPO表現(xiàn)一定的活性，其中鄰苯二酚的活性最大；苯酚和愈創(chuàng)木酚都對(duì)PPO不表現(xiàn)活性。

2.5 pH值對(duì)宣木瓜PPO活性的影響

圖4 pH值對(duì)PPO活性的影響Fig.4 Effect of pH on the activity of PPO from C. speciosa fruit

由圖4可知，宣木瓜PPO對(duì)pH值較為敏感。在pH5.5時(shí)，PPO達(dá)到最大活性，隨著pH值的上升和下降，酶活都迅速下降。當(dāng)pH值在3.0和9.0時(shí)，PPO活性分別為最大酶活的36%和34%。PPO是含銅蛋白質(zhì)，在酸性條件下酶中的銅易被解離出來(lái)，使酶失活；而在堿性條件下，銅會(huì)解離成氫氧化銅，使酶活性顯著降低。所以在工業(yè)生產(chǎn)中，可以通過(guò)調(diào)節(jié)環(huán)境的pH值來(lái)抑制宣木瓜多酚氧化酶的活性。

圖5 PPO的pH值穩(wěn)定性Fig.5 pH stability of PPO from C. speciosa fruit

由圖5可以看出，PPO在pH4.0～7.0的穩(wěn)定性較好。在pH4.0和pH5.0體系中，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，酶的活性變化很小，這可能與宣木瓜本身酸度較大有一定的關(guān)系。當(dāng)pH8.0時(shí)，對(duì)PPO的活性影響較大，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，活性不斷下降，在體系中保持15min后，活性約為最大活性的42%。結(jié)果說(shuō)明，宣木瓜PPO在酸性環(huán)境中穩(wěn)定性較好，受堿性環(huán)境影響較大，穩(wěn)定較差。

2.6 溫度對(duì)PPO活性的影響

圖6 溫度對(duì)PPO活性的影響Fig.6 Effect of temperature on the activity of PPO from C. speciosa fruit

不同溫度對(duì)PPO的活性影響如圖6所示。在10～30℃，PPO都有較高的活性，在20℃時(shí)達(dá)到最大的活性。隨著溫度的上升，酶活逐漸下降，當(dāng)達(dá)到80℃時(shí)，活性下降較大，可能是由于高溫致使酶蛋白發(fā)生變性。相關(guān)報(bào)道表明不同果蔬或者不同品種的多酚氧化酶最適溫度都不盡相同[6,8,15-17]，本實(shí)驗(yàn)得到的最適溫度為20℃。

圖7 宣木瓜PPO 對(duì)溫度的穩(wěn)定性Fig.7 Temperature stability of PPO from C. speciosa fruit

由圖7可知，在40℃和50℃時(shí)，宣木瓜的穩(wěn)定性較好，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，活性幾乎沒(méi)有損失。隨著溫度的上升，PPO的穩(wěn)定性越來(lái)越差，在70℃中保持20min，活性只有最大活性的18%，在80℃中保持5min，酶基本失去活性。說(shuō)明宣木瓜PPO受溫度的影響較大，穩(wěn)定性較差，高溫可達(dá)到滅活的目的，有效地抑制酶促褐變。

2.7 抑制劑對(duì)PPO活性的影響

本試驗(yàn)選取了食品中常見的抗壞血酸、L-半胱氨酸、氯化鈉、檸檬酸和亞硫酸氫鈉等酶活抑制劑，研究它們對(duì)宣木瓜酶活的抑制效果。不同質(zhì)量濃度的抑制劑對(duì)PPO活性影響如圖8、9所示。

圖8 抑制劑對(duì)酶活的影響Fig.8 Effects of ascorbic acid, L-cysteine, sodium bisulfite on the activity of PPO from C. speciosa fruit

從圖8可以看出，抗壞血酸、L-半胱氨酸、亞硫酸氫鈉對(duì)宣木瓜PPO活性有較強(qiáng)的抑制效果。隨著質(zhì)量濃度的加大，PPO活性逐步下降。當(dāng)抗壞血酸和L-半胱氨酸質(zhì)量濃度達(dá)到0.025g/100mL時(shí)，酶的活性完全受到抑制，亞硫酸氫鈉質(zhì)量濃度在3g/100mL時(shí)，酶不表現(xiàn)出活性。

由于抗壞血酸在果蔬組織中還會(huì)與氨基酸反應(yīng)，造成非酶褐變，此外，在高溫條件下，抗壞血酸會(huì)氧化形成酮化合物，與胺化合物發(fā)生非酶褐變。所以在實(shí)際的生產(chǎn)過(guò)程中，抗壞血酸的加入量必須合適，以免加入不當(dāng)，反而加劇了產(chǎn)品的褐變。亞硫酸氫鈉雖有較好的抑制效果，但由于它破壞營(yíng)養(yǎng)，使組織軟化并產(chǎn)生異味，且有害健康，美國(guó)FDA已對(duì)其使用做出限制[18]。

圖9 檸檬酸、氯化鈉對(duì)PPO活性的影響Fig.9 Effect of citric acid and sodium chloride on the activity of PPO from C. speciosa fruit

由圖9可知，檸檬酸和氯化鈉對(duì)PPO都有一定的抑制效果，但是相對(duì)于以上3種抑制劑效果較差。隨著濃度的加大，酶活抑制程度也逐步加大。當(dāng)檸檬酸質(zhì)量濃度在5g/100mL時(shí)，PPO的相對(duì)活性為82%；氯化鈉在質(zhì)量濃度5g/100mL時(shí)的相對(duì)活性為73%。相關(guān)報(bào)告表明，當(dāng)檸檬酸、氯化鈉與其他抑制劑組成復(fù)合抑制劑，可以起到較大的抑制作用[19-20]。

3 結(jié) 論

3.1 宣木瓜的褐變主要是由多酚氧化酶引起，且果心和果皮中多酚氧化酶活性較高，在加工中應(yīng)注意去盡果心和果皮，避免影響產(chǎn)品的價(jià)值。

3.3 試驗(yàn)說(shuō)明，宣木瓜PPO的最適底物為鄰苯二酚，對(duì)焦性沒(méi)食子酸、綠原酸、沒(méi)食子酸都有一定的催化活性。通過(guò)試驗(yàn)結(jié)果可初步推斷出宣木瓜PPO對(duì)多元酚表現(xiàn)一定的活性，而對(duì)一元酚不表現(xiàn)出活性。宣木瓜PPO的最適pH值為5.5，在酸性條件下PPO較為穩(wěn)定，堿性條件下穩(wěn)定較差；最適溫度為20℃，耐熱性較差，80℃處理5min活性基本喪失。在加工應(yīng)用中，可采取調(diào)節(jié)環(huán)境pH和熱燙滅酶的辦法來(lái)防止酶促褐變的發(fā)生。

3.4 抗壞血酸、L-半胱氨酸、亞硫酸氫鈉、檸檬酸和氯化鈉都對(duì)宣木瓜PPO有抑制作用。其中抗壞血酸、L-半胱氨酸和亞硫酸氫鈉對(duì)PPO的抑制效果較好，低濃度即可達(dá)到完全抑制。本實(shí)驗(yàn)還研究了不同濃度的EDTA-2Na對(duì)宣木瓜PPO活性的影響，但是發(fā)現(xiàn)EDTA-2Na對(duì)宣木瓜的PPO抑制效果不明顯。目前，在加工過(guò)程中提倡多種抑制劑結(jié)合使用以提高防褐變效果，因此還需在對(duì)宣木瓜單一抑制劑研究的基礎(chǔ)上，對(duì)不同抑制劑多因素協(xié)同作用機(jī)理和抑制效應(yīng)做進(jìn)一步的研究。

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Enzymatic Characteristics and Inhibitors of Polyphenol Oxidase from Chaenomeles speciosa Nakai Fruits

ZHANG Guo-qing，DONG Ming*，LI Na， YU Ya-qiong，WANG Xu-dong
(College of Tea and Food Science and Technology, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China)

Effects of temperature, pH, substrate, ascorbic acid, L-cysteine, sodium bisulfite, citric acid and sodium chloride on the activity of polyphenol oxidase (PPO) from Chaenomeles speciosa Nakai were studied. Results showed that PPO activity was obviously higher in core than in the peel and flesh. The browning of C. speciosa fruit was significantly correlated to PPO activity. The PPO from C. speciosa fruit had the optimum substrate of catechol, with the optimum temperature 20 ℃ and pH 5.5. The enzyme lost its activity substantially after exposure to 80 ℃ for 5 min. Its activity was suppressed effectively by ascorbic acid, L-cysteine, sodium bisulfite, citric acid and sodium chloride.

Chaenomeles speciosa Nakai；polyphenol oxidase；characteristic；inhibitor

TS255.1

A

1002-6630(2011)10-0288-04

2010-09-05

張國(guó)慶(1987—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏工程。E-mail：nanlingzhang@gmail.com

*通信作者：董明(1958—)，男，副教授，碩士，研究方向?yàn)楣呒庸づc貯運(yùn)技術(shù)。E-mail：dongm58@163.com