糖尿病內(nèi)皮祖細胞的研究

王曉霞綜述 趙 明審校

糖尿病內(nèi)皮祖細胞的研究

王曉霞1綜述 趙 明2審校

本文2010—12—20收到，2011—02—18修回，2011—02—23接受

自1997年Asahara從人外周血單個核細胞首次分離出內(nèi)皮祖細胞（Endothelial Progenitor Cells，EPCs）［1］以來，人們對其進行了大量研究。結果表明，EPCs是具有遷移、增殖、粘附和分化成內(nèi)皮細胞功能的前體細胞，不僅參與胚胎期血管的形成，也參與成人新生血管的發(fā)生。目前把表達CD34和血管內(nèi)皮生長因子受體（KDR）的細胞定義為 EPCs（CD34＋KDR＋）［2］。有報道稱1 型糖尿病（Type 1 Diabetes Mellitus，T1DM）及2型糖尿病（Type 2 Diabetes Mellitus，T2DM）患者外周血中存在EPCs數(shù)量減少及功能障礙［1］。深入研究EPCs在糖尿病，尤其在伴發(fā)血管病變中的重要作用，對于認識EPCs作為糖尿病血管病變的一種新的發(fā)生機制及使其成為潛在的治療靶點具有重要意義。

1 EPCs概述

骨髓、臍血、外周血均含有EPCs，且三者之比約為15∶10∶1［3］。將外周血單個核細胞接種于纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)板上，培養(yǎng)至第4天時，培養(yǎng)板上出現(xiàn)呈紡錘體形狀的貼壁細胞，稱為早期EPCs；7～14天時部分貼壁細胞形態(tài)呈鵝卵石樣改變，類似于成熟的內(nèi)皮細胞，稱為晚期EPCs。早期EPCs表達CD14、CD45，高表達血管內(nèi)皮生長因子（Vas-cular Endothelial Growth Factor，VEGF）、白細胞介素-8（In-terleukin，IL-8）、粒細胞集落刺激因子（Granulocyte Colony—Stimulating Factor，G-GSF）。免疫 組 化 鑒定提示，晚 期EPCs主要表達成熟內(nèi)皮細胞標記物血小板內(nèi)皮細胞粘附分子 （Platelet／endothelial Cell Dhesion Molecule-1，PECAM-1）、血管性假血友病因子（von Willebrand Factor，v WF）、血管內(nèi)皮細胞鈣粘蛋白（Vascular Endothelial Cadherin，VEC）、內(nèi)皮細胞氮氧化物合酶（Endothelial Nitric Oxide Synthase，eNOS），且增殖能力較早期EPCs更強，體外生存時間也更長，具有形成血管樣結構的能力［4］。此外，晚期EPCs還表達CD34、KDR及AC133，但對AC133的表達不同于造血祖細胞和白細胞，因為它很快就消失了，現(xiàn)在體外研究的EPCs主要表達CD34及KDR（CD34＋KDR＋）。

2 糖尿病患者外周血EPCs的變化及機制

2.1 血糖水平對EPCs的影響

Churdchomjan等［5］采用不同濃度的葡萄糖（7.8、10.5、13.5、16.5、19.5mmol／L）干預外周血來源的 EPCs不同時間，觀察EPCs的數(shù)量（7天）、增殖能力（14、21天）及凋亡情況（7、14天），結果發(fā)現(xiàn)葡萄糖呈量效關系減少EPCs的數(shù)量（P＜0.05），呈量效和時效關系降低EPCs的增殖能力（P＜0.05），呈量效和時效關系增加EPCs的凋亡率；該研究還顯示，糖尿病患者外周血中EPCs的數(shù)量與患者空腹血糖及糖化血紅蛋白（Hb A1c）呈負相關，表現(xiàn)為EPCs數(shù)量減少，并認為這種減少與EPCs壽命縮短或骨髓EPCs動員減少有關，其中壽命縮短可能由于細胞增殖減少和細胞死亡加速所致。研究表明，高糖條件下，靜息狀態(tài)的EPCs不斷累積時，增殖狀態(tài)的EPCs數(shù)量在不斷減少［6］，這種減少與P16及P21蛋白表達水平的上調(diào)有關。因為P16及P21均在細胞周期調(diào)控表達中起重要作用，屬于細胞周期蛋白激酶抑制蛋白，對G1／S轉換起負調(diào)節(jié)作用，而P16及P21蛋白表達水平的改變與幾種類型細胞的凋亡有關。還有研究表明，高糖能夠上調(diào)在EPCs增殖、存活及分化中起重要作用的E—Twenty six（ETS）轉錄因子，繼而增強表達非內(nèi)皮ETS靶基因基質金屬蛋白酶類（Matrix Metalloproteinases，MMPs）及CD115，抑制表達內(nèi)皮標志物CD105，影響EPCs向內(nèi)皮細胞的分化，致EPCs功能活動受阻［7］。也有研究認為，高糖通過p38促分裂原活化蛋白激酶（Mitogen-Activated Protein Kinase，p38MAPk）加速EPCs衰老，且減少循環(huán)中EPCs數(shù)量［8］，而一氧化氮（NO）的供體硝普鈉（Sodium Nitroprus-side，SNP）［9］或p38MAPK阻滯劑SB230580明顯改善高糖對EPCs數(shù)量和增殖的抑制作用［5］。此外近來研究表明，磷脂酰肌醇-3激酶（Phosphatidylinositol 3’Kinase，PI3K）／絲氨酸—蘇氨酸激酶（Serine-Threonine Kinase，AKT）／eNOS［PI3K／AKT／eNOS］信號轉導通路在阻止高糖致細胞損傷中也發(fā)揮重要作用，PI3K／AKT能夠阻止EPCs死亡，導致細胞存活及激活eNOS、增加NO產(chǎn)量。

2.2 胰島素、胰島素抵抗對EPCs的影響

體外研究表明，胰島素能夠增加培養(yǎng)基中EPCs，尤其是早期EPCs和單個核細胞的數(shù)量［10］。超生理劑量胰島素影響EPCs從骨髓動員至外周血以及降低EPCs與受損內(nèi)皮細胞的結合能力，取決于內(nèi)皮細胞胰島素樣生長因子（Insulin-Like Growth Factor，IGF）-1及其受體-2（IGF-R2），因IGF—1／IGF-R2是 EPCs的主要管理者［11，12］。超生理劑量胰島素甚至能夠產(chǎn)生促氧化效應，與糖尿病患者胰島素抵抗所達到的超生理劑量的胰島素產(chǎn)生的促動脈粥樣硬化效應可能有關［13，14］。胰島素抵抗通過減少細胞周期蛋白 E（Cyclin E）、細胞周期蛋白依賴激酶-2（cyclin dependent kinase-2，cdk-2）及增殖細胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Anti-gen，PCNA）的表達而減少EPCs增殖，通過過度表達caspase-3、激活細胞內(nèi)蛋白降解程序而致細胞凋亡［15］。胰島素與受體結合，通過胰島素受體底物激活PI3K途徑，直接磷酸化e NOS，使eNOS活性增強，NO產(chǎn)生增加；而胰島素抵抗通過增加內(nèi)皮細胞脂肪酸氧化而降低eNOS活性，是導致糖尿病患者發(fā)生動脈粥樣硬化和心血管疾病的另一種潛在機制［16］。研究表明大多數(shù)人體組織中eNOS受損與高糖及糖尿病相關，短期使用胰島素并不能逆轉eNOS磷酸化作用受損，不能增加NO產(chǎn)量，而促進EPCs動員及傷口愈合［16］。在體內(nèi)，胰島素能夠阻止細胞遷移和新生內(nèi)膜的增長，增強EPCs功能，改善動脈損傷后的再內(nèi)皮化［17］。

2.3 eNOS、MMPs對EPCs的影響

骨髓來源的EPCs在血管生成及歸巢到外周血中對傷口愈合起關鍵作用。eNOS的表達及磷酸化作用對于EPCs的存活、遷移、血管發(fā)生至關重要。骨髓中EPCs在組織缺氧所誘導釋放的血管內(nèi)皮生長因子A及由骨髓間質eNOS活化而增加NO釋放的作用下動員至外周血中，隨后在缺血組織誘導表達的，作為EPCs歸巢的信號基質源因子-1α（Stromal Cell-Derived Factor，SDF-1α）的趨化作用下趨化至缺血組織，參與組織水平的血管生成及傷口愈合［18］。來源于eNOS的NO可通過亞硝基化和提高組織VEGF的表達來促進EPCs的動員，VEGF還通過對AKT和e NOS 1177位點的絲氨酸磷酸化作用反饋促進EPCs的動員和血管生成［8］。骨髓eNOS活化功能受損致EPCs動員至外周血中減少可能由骨髓間質基質細胞和淋巴細胞數(shù)量減少所致。EPCs減少能夠被高壓氧治療所逆轉［18］。MMPs是一組具有類似結構及共同生物化學性質的金屬依賴性蛋白水解酶超基因家族，是細胞外基質的主要降解酶系統(tǒng)，能降解多糖以外的所有細胞外基質成分如膠原及彈性蛋白，其活性受金屬蛋白酶組織抑制劑（Tissue Inhibitor of Metalloproteinase，TIMPs）的調(diào)節(jié)。迄今發(fā)現(xiàn)的28種 MMP中，MMP-2及MMP-9是Ⅳ型膠原酶的兩種存在形式。近來研究表明，糖尿病小鼠的組織缺血，可誘導VEGF、缺氧誘導因子-1α（Hy—poxia-Inducible Factor，HIF-1α）、白介素-1β（IL-1β）表達受損，而使 MMP-2及 MMP-9表達過度，TIMPs表達下降［19］。HIF-1α是VEGF的轉錄因子，VEGF動員EPCs從骨髓中進入外周血中，HIF-1α活化可調(diào)節(jié)VEGF的表達。正常小鼠中，VEGF、HIF-1α及其誘導劑IL-1β表達均顯著增加，且同時達峰值。糖尿病小鼠的VEGF表達受損與HIF-1α及IL-1β的低表達相關。其機制可能是高糖通過氧化應激和糖基化終產(chǎn)物上調(diào)MMPs的表達［20］，或抑制NO的作用而增強MMPs的活化［21］。MMPs一方面通過使kit膜型配體變成可溶解形式，促使EPCs動員至外周血中［22］，另一方面通過自身拮抗作用拮抗VEGF的效應［23］。

2.4 外周血管病變（Peripheral Vascular Disease，PVD）與EPCs

PVD是T2DM中一種普遍而嚴重的并發(fā)癥，T2DM的側支血管代償不足是PVD發(fā)病的原因之一。踝臂指數(shù)（Ankle Brachial Index，ABI）是下肢血管病變最客觀的診斷試驗，也是檢測心血管風險最可靠的標記物。EPCs進行性減少平行于T2DM外周血管病變的嚴重性，CD34＋KDR＋細胞水平負相關于ABI、下肢動脈閉塞的臨床狀態(tài)及頸動脈狹窄的最大程度［2］。EPCs的減少在PVD的病理生理中起作用，因為EPCs減少促成內(nèi)皮功能障礙，加速動脈硬化進程，導致血管病變，如糖尿病足部損害等［23］。研究發(fā)現(xiàn)，下肢血管缺血患者用促血管生成治療的臨床效果并不理想［24］，提示該類患者可能缺少血管生成最原始的細胞EPCs，而僅靠細胞因子是不夠的［25］。近來，局部缺血綜合癥患者應用EPCs進行細胞治療時發(fā)現(xiàn)，骨髓來源的EPCs若其分化能力及血管形成能力受損，則不能用于血管治療［26］，但可在EPCs的體外擴增過程中進行基因轉導來解決EPCs的這些功能缺陷。進行表型調(diào)整的EPCs的應用可能減少移植所需EPCs的數(shù)量，尤其對自體移植更具優(yōu)勢。

3 結語

EPCs參與出生后器官和組織的血管新生及受損血管的修復以及維持血管壁的完整性。隨著研究的不斷深入，EPCs將會在改善組織缺血與血管再生方面發(fā)揮重要作用。如應用EPCs治療糖尿病各種血管并發(fā)癥將成為一個新的治療靶點，對增殖型視網(wǎng)膜病變通過控制局部的EPCs聚集與分化，從而減少不良血管的生成、改善愈后等，均有利于提高糖尿病患者的生存質量。

本文作者簡介：

王曉霞（1989～），女，漢族，碩士研究生

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R587.1

A

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1南京大學醫(yī)學院臨床學院（南京軍區(qū)南京總醫(yī)院），郵政編碼 南京210093；2南京軍區(qū)南京總醫(yī)院干部病房2科；

趙 明，E-mail：zhao1961＠126.com