HPLC法同步檢測(cè)鯉魚、對(duì)蝦中喹乙醇與MQCA殘留

梅景良,吳聰明,程林麗,沈建忠,薛 麒,錢民怡,邵夢(mèng)瑜

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,北京 100193; 2.福建農(nóng)林大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,福建 福州350002)

喹乙醇(Olaquindox,OLA)是一種化學(xué)合成的廣譜抗菌藥,對(duì)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌均具有一定的抑制作用,同時(shí)對(duì)動(dòng)物具有顯著的促生長(zhǎng)作用[1-2]。因此自20世紀(jì)70年代起,歐共體、澳大利亞、日本和中國(guó)等陸續(xù)批準(zhǔn)該藥作為飼料添加劑使用,在畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖中曾得到廣泛應(yīng)用[3]。但后來(lái)逐漸發(fā)現(xiàn),喹乙醇具有光敏毒性[4]、致突變和致癌作用[5-8],是一種潛在的基因毒劑[9-11]?；诖?歐盟認(rèn)為喹乙醇的休藥期不能確定,并對(duì)人體健康可能存在不良影響,因此,于 1999年禁止在食品動(dòng)物生產(chǎn)中使用該藥作促生長(zhǎng)添加劑[8,12]。我國(guó)于 2000年規(guī)定喹乙醇禁用于禽類和體重超過(guò)35 kg的豬,在2005年又規(guī)定禁用于魚類。盡管如此,喹乙醇在我國(guó)仍然作為抗菌促生長(zhǎng)添加劑被廣泛使用[8]。

由于喹乙醇具有較大危害性,對(duì)其進(jìn)行殘留監(jiān)控是十分必要的。但喹乙醇本身不穩(wěn)定,在動(dòng)物體內(nèi)能夠于短時(shí)間內(nèi)被代謝,其代謝產(chǎn)物有十多種,其中 3-甲基-喹噁啉-2-羧酸(methyl-3-quinoxaline-2-carboxylic acid,MQCA)是主要代謝物,在體內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定,現(xiàn)已成為國(guó)際公認(rèn)的喹乙醇在可食性動(dòng)物組織中的殘留標(biāo)示物[13]。國(guó)內(nèi)外已有較多關(guān)于喹乙醇及其代謝物MQCA的殘留檢測(cè)方法,如高效液相色譜(HPLC)法、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)、免疫分析法等[14-18]。這些檢測(cè)方法有的是針對(duì)喹乙醇的原藥殘留的測(cè)定,其結(jié)果不能體現(xiàn)喹乙醇在動(dòng)物體內(nèi)的真實(shí)殘留情況,而有的方法雖然是針對(duì) MQCA的檢測(cè),但未測(cè)定原藥的殘留量,而且其前處理過(guò)程太繁瑣,耗時(shí)較長(zhǎng),顯然不利于實(shí)際樣品的大規(guī)模檢測(cè)[19-21]。更主要的是,由于MQCA既是喹乙醇在動(dòng)物源食品中的殘留標(biāo)示物,同時(shí)也是喹烯酮等其他喹啉類藥物的殘留標(biāo)示物[22-23],因此若單純以 MQCA為殘留分析物,即使檢測(cè)到陽(yáng)性樣品,也只能說(shuō)明陽(yáng)性樣品曾用過(guò)喹啉類藥物,并不能知道用的是這一類藥物中的哪一具體品種。但對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物而言,喹乙醇是禁用藥,其他喹啉類藥物為非禁用藥,也就是說(shuō),如果想知道這些陽(yáng)性樣品是否是因使用喹乙醇而導(dǎo)致的 MQCA殘留,就必須再進(jìn)行一次喹乙醇的殘留檢測(cè)才能確定。本項(xiàng)目的研究旨在建立一種能同時(shí)檢測(cè)魚、蝦中喹乙醇及其代謝物MQCA殘留的HPLC方法,以利于基層質(zhì)檢機(jī)構(gòu)更有效、更快捷地檢測(cè)喹乙醇及其代謝物的殘留。

1 材料與方法

1.1 儀器與試驗(yàn)材料

Waters2695高效液相色譜儀,配二極管陣列檢測(cè)器(美國(guó)Waters公司); 離心機(jī); Bond Elut C18固相萃取柱,500 mg,6 mL(美國(guó)Varian公司); 組織勻漿機(jī);氮吹儀; 渦旋混合器; 微孔濾膜,0.22 μm。

甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純; 其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純; 水為超純水。

OLA 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(100 mg/L)：準(zhǔn)確稱取(10±0.01)mg的喹乙醇標(biāo)準(zhǔn)品(純度98.4%,中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所),用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移到棕色容量瓶中定容至100 mL。

MQCA 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(100 mg/L)：準(zhǔn)確稱取(10±0.01) mg 的 3-甲基-喹啉-2-羧酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度94%,德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司),用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移到棕色容量瓶中定容至100 mL。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：根據(jù)使用需要,用甲醇將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液,在4℃冰箱中保存,可使用2周。

復(fù)溶液：水-0.5%甲酸水-乙腈-甲醇混合溶液(30：40：5：25,V/V)。

供試驗(yàn)所用的活鯉魚及活對(duì)蝦均購(gòu)自北京某超市,將其可食用部分絞碎勻漿,于-20℃冰箱中貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理

將組織樣品從低溫冰箱中取出,室溫解凍。取2.5 g組織至50 mL的離心管中,加入7 mL 0.3 mol/L和1 mL 1mol/L 的HCl溶液,渦旋振蕩提取2 min,3 900 r/min離心10 min,將上清液轉(zhuǎn)至15 mL尖底塑料離心管中。殘?jiān)尤? mL 0.3 mol/L HCl溶液再提取1次,將上清液合并至尖底塑料離心管中。上清液以3 900 r/min離心10 min,于冰箱冷藏靜置1 h,最后用C18固相萃取柱凈化。依次用5 mL甲醇和3 mL 0.3 mol/L HCl活化小柱,2 mL超純水淋洗,再依次用3 mL甲醇和1 mL乙腈洗脫至玻璃試管中,于35℃氮?dú)獯蹈?。最后各組織殘?jiān)?.5 mL復(fù)溶液渦旋振蕩溶解1 min,并于3 900 r/min離心15 min,用0.22 μm濾膜過(guò)濾,濾液進(jìn)行HPLC分析。

1.2.2 HPLC色譜條件

色譜柱：Inertsil? ODS-3 C18 柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),日本 GL Sciences公司產(chǎn)品; 柱溫 30℃; 進(jìn)樣量 100 μL; 樣品運(yùn)行時(shí)間為 20 min; 雙波長(zhǎng)檢測(cè),OLA的檢測(cè)波長(zhǎng)為 372 nm,MQCA的檢測(cè)波長(zhǎng)為320 nm; 流動(dòng)相由純水、乙腈、甲醇和0.5%甲酸水組成,梯度洗脫,具體設(shè)定條件見(jiàn)表 1。采用外標(biāo)法定量。

表1 測(cè)定OLA與MQCA的流動(dòng)相梯度洗脫條件Tab.1 Gradient elution for OLA and MQCA analysis

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

標(biāo)準(zhǔn)貯備液用復(fù)溶液稀釋配制成各含 OLA和MQCA 為 0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 和 1 μg/mL 的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,取100 μL按1.2.2項(xiàng)下的 HPLC色譜條件進(jìn)樣分析。分別以O(shè)LA和MQCA的峰面積為縱坐標(biāo)(Y),OLA和MQCA的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并求回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.2.4 檢測(cè)限與定量限的確定

稱取6個(gè)空白組織樣品,按1.2.1項(xiàng)下的樣品處理方法進(jìn)行提取和凈化,同時(shí)設(shè) 0.02 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液作對(duì)照,對(duì)空白組織樣品和標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行HPLC分析。計(jì)算OLA和MQCA色譜保留時(shí)間位置的信噪比,以空白樣品的 3倍信噪比(S/N=3)計(jì)算檢測(cè)限(limits of detection,LOD),以 10倍信噪比(S/N=10)計(jì)算定量限(limits of quantification,LOQ)。

1.2.5 回收率與精密度的測(cè)定

取2.5 g(精確至0.01g)空白鯉魚、對(duì)蝦組織樣品,鯉魚組織樣品OLA以20、80、200 μg/kg,MQCA以35、100、200 μg/kg; 對(duì)蝦組織樣品 OLA 以 15、80、200 μg/kg,MQCA 以 30、100、200 μg/kg 各 3 個(gè)濃度,分別進(jìn)行添加回收試驗(yàn),按 1.2.1項(xiàng)下方法處理,在1.2.2項(xiàng)條件下進(jìn)行 HPLC測(cè)定,將峰面積乘以樣品處理中的稀釋倍數(shù),與相應(yīng)濃度的 3個(gè)隨行標(biāo)準(zhǔn)工作液峰面積平均值比較,計(jì)算回收率。每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)平行,連續(xù)做 3 d,計(jì)算日內(nèi)和日間變異系數(shù)即批內(nèi)和批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果

2.1 方法的線性范圍及檢測(cè)限

在本試驗(yàn)所建立的色譜條件下,OLA和MQCA標(biāo)準(zhǔn)工作液在0.02～1.00 μg/mL濃度范圍內(nèi),峰面積(Y)與濃度(X)呈良好的線性關(guān)系,其線性回歸方程分別為：Y=266652X-523.88,R=0.9999;Y=181144X-25.76,R=0.9999。

根據(jù) 6個(gè)空白組織樣品基線噪音值的平均值,按信噪比S/N=3計(jì)算LOD,信噪比S/N=10計(jì)算LOQ,求的鯉魚肌肉組織中OLA和MQCA的LOD分別為6 和 10 μg/kg,LOQ 分別為 20 和 35 μg/kg; 對(duì)蝦組織中OLA和MQCA的LOD分別為4.5和8 μg/kg,LOQ分別為 15和 30 μg/kg。

2.2 藥物的色譜行為

在 1.2.2項(xiàng)色譜條件下測(cè)定,色譜峰對(duì)稱性好,藥物峰與溶劑峰及基質(zhì)干擾峰分離較好,可準(zhǔn)確測(cè)定其峰面積(見(jiàn)圖1～圖4)。且該條件下藥物保留時(shí)間的重現(xiàn)性好,以蝦某濃度添加水平為例,OLA及MQCA 的保留時(shí)間分別為(4.464±0.009)min和(12.657±0.028)min,變異系數(shù)分別僅為 0.20%和0.22%(n=15)。

2.3 回收率和精密度

在空白鯉魚肌肉組織和對(duì)蝦組織中分別添加低、中、高3個(gè)不同濃度水平OLA和MQCA的標(biāo)準(zhǔn)溶液,按所述方法進(jìn)行測(cè)定,并計(jì)算出各加標(biāo)樣品的回收率,見(jiàn)表 2、表 3。鯉魚肌肉組織中 OLA3個(gè)不同添加濃度的平均回收率為 83.5%～87.7%,MQCA 的平均回收率為 79.6%～87.4%; 對(duì)蝦肌肉組織中 OLA3個(gè)不同添加濃度的平均回收率為74.6%～80.9%,MQCA的平均回收率為81.0%～86.6%,均符合獸藥殘留分析的準(zhǔn)確度要求。批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為 0.51%～4.47%,小于 5%; 批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.66%～7.58%,小于10%,皆符合獸藥殘留分析的精確度要求。

圖1 鯉魚魚肌肉組織中OLA的HPLC色譜圖Fig.1 Liquid chromatograms of OLA in carp muscle tissues

圖2 鯉魚肌肉組織中MQCA的HPLC色譜圖Fig.2 Liquid chromatograms of MQCA in carp muscle tissues

圖3 對(duì)蝦肌肉組織中OLA的HPLC色譜圖Fig.3 Liquid chromatograms of OLA in shrimp muscle tissues

圖4 對(duì)蝦肌肉組織中MQCA的HPLC色譜圖Fig.4 Liquid chromatograms of MQCA in shrimp muscle tissues

3 討論

3.1 提取與凈化條件的選擇

目前在OLA或MQCA殘留色譜法檢測(cè)的樣品制備中,殘留物的提取主要是采用水提取[24-27],偏磷酸甲醇溶液、乙酸乙酯及磷酸鹽緩沖液依次提取[21,28-29],氫氧化鈉溶液水解、乙酸乙酯重復(fù)提取[22-23,30],蛋白酶酶解、鹽酸溶液或乙酸乙酯提取[19-20,31],以及用乙腈和乙酸乙酯提取[32]。在本研究中比較了鹽酸溶液、氫氧化鈉溶液、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑提取,以及這些提取液的不同組合提取,并比較了提取液的用量、用時(shí)、溫度、次數(shù)和pH值。結(jié)果表明,僅采用 0.3 mol/L鹽酸溶液水解即可將OLA及MQCA從鯉魚組織或?qū)ξr組織中同時(shí)分離提取出來(lái),且與同等試驗(yàn)條件下氫氧化鈉溶液水解相比,鹽酸水解可減少提取液中的雜質(zhì)成分,提高后續(xù)的凈化效果和方法回收率。本文經(jīng)過(guò)對(duì)比研究之后尚發(fā)現(xiàn),若再適當(dāng)增加提取液的酸性還可提高M(jìn)QCA的提取效果,因此在初次提取液 7 mL 0.3 mol/L中增加使用了1 mL 1 mol/L鹽酸。

表2 鯉魚肌肉組織中OLA及MQCA的提取回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Tab.2 Recoveries and RSDs of OLA / MQCA in carp muscle tissues

在OLA及MQCA殘留檢測(cè)的樣品制備過(guò)程中,提取液內(nèi)殘留物的純化技術(shù)基本上是采用固相萃取法,并以使用MAX小柱[20-21,28-29]和SCX小柱[19]為主,但也有的是直接利用液液萃取進(jìn)行凈化的[22-23,30]。本研究采用的是固相萃取法,并對(duì)MAX、MCX、HLB、C18、中性氧化鋁柱等幾種小柱的凈化效果進(jìn)行了比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn) C18小柱可同時(shí)較好地保留 OLA和M Q C A。研究中尚對(duì)淋洗液和洗脫液的種類及用量進(jìn)行了大量的篩選和優(yōu)化,結(jié)果表明用2 mL超純水淋洗、3 mL甲醇和1 mL乙腈依次洗脫即可達(dá)到較好的凈化效果和較高的方法回收率。至于在凈化過(guò)程中是否需要采用正己烷進(jìn)行脫脂這一步驟,可視情況而定,以盡量避免不必要的回收率損失。如蝦肌肉組織的含脂量極低,對(duì)檢測(cè)基本不存在干擾現(xiàn)象,可不必進(jìn)行脫脂; 而魚肌肉組織存在一定的含脂量,但其高低與魚的種類和不同季節(jié)有很大的關(guān)系,在實(shí)際工作中若發(fā)現(xiàn)含脂量較大而干擾正常檢測(cè)時(shí),就必須采用適量的正己烷進(jìn)行脫脂,一般可在氮吹殘?jiān)鼜?fù)溶后用2 mL正己烷脫脂即可獲得滿意的效果。

表3 對(duì)蝦肌肉組織中OLA及MQCA的提取回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Tab.3 Recoveries and RSDs of OLA / MQCA in shrimp muscle tissues

3.2 色譜條件的選擇

由于在OLA及MQCA的HPLC法殘留分析中,使用的色譜柱基本上是 C18柱[19-21,28-32],本研究便直接采用色譜性能較好的Inertsil ODS-3 C18柱作為HPLC柱。不過(guò),在不同的研究中所使用的流動(dòng)相卻存在著很大的差別[19-21,28-30]。經(jīng)過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn),這些流動(dòng)相也基本上都是由水相和有機(jī)相混合而成,水相一般是純水或低濃度甲酸水,有機(jī)相是甲醇、乙腈或二者都有,采用等度或梯度洗脫。因此,在選定色譜柱之后,本研究對(duì)以水、甲酸水、甲醇及乙腈組成的不同組合流動(dòng)相進(jìn)行了比較,結(jié)果表明以 0.1%甲酸水-甲醇-乙腈為流動(dòng)相時(shí)分離效果較好,但 MQCA的峰型較寬,拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重。又對(duì)流動(dòng)相繼續(xù)進(jìn)行了優(yōu)化,最后發(fā)現(xiàn)當(dāng)采用1.2.2項(xiàng)下的流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí),OLA及MQCA的保留時(shí)間和峰型均非常理想,且與干擾峰之間能獲得很好的分離結(jié)果。

OLA和MQCA在近紫外光區(qū)有較強(qiáng)的特征吸收峰,但是二者的最大吸收波長(zhǎng)不同。為了使OLA和MQCA均能獲得較高的靈敏度,本研究通過(guò)DAD全波段掃描(200～400 nm),考察了不同檢測(cè)波長(zhǎng)對(duì)OLA、MQCA測(cè)定靈敏度的影響,結(jié)果表明,當(dāng)OLA以372 nm,MQCA以320 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí),檢測(cè)的靈敏度均較高,并且在空白樣品添加測(cè)定中能排除其他物質(zhì)峰的干擾,因而將其作為鯉魚、對(duì)蝦組織中OLA和MQCA同步測(cè)定的最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。在選定的色譜條件下對(duì)鯉魚、對(duì)蝦兩種組織中添加的OLA和MQCA進(jìn)行同步測(cè)定,獲得了較為理想的研究結(jié)果。

4 結(jié)論

采用高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)鯉魚、對(duì)蝦肌肉組織中喹乙醇及其代謝物MQCA殘留,通過(guò)稀鹽酸提取,優(yōu)化流動(dòng)相的配比,可有效分離干擾峰和喹乙醇及其代謝物的色譜峰。本方法可操作性強(qiáng)、重復(fù)性好,將有助于基層質(zhì)檢機(jī)構(gòu)更有效、更快捷地檢測(cè)喹乙醇及其代謝物的殘留,以避免含喹乙醇?xì)埩舻耐愃a(chǎn)品在國(guó)內(nèi)市場(chǎng)流通和進(jìn)入國(guó)際市場(chǎng)。

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