海洋微生物活性胞外多糖的研究進(jìn)展

孫海紅,毛文君,錢葉苗,宋相麗

(1.海洋化工研究院,山東 青島 266071; 2.中國(guó)海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院,山東 青島 266003)

海洋是生命資源的寶庫,地球上的生物 80%存在于海洋,海洋生物物種遠(yuǎn)比陸地生物豐富和復(fù)雜。海洋微生物是海洋生物的重要組成部分,是重要的海洋自然資源。近些年來,海洋微生物胞外多糖獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性研究在海洋生態(tài)學(xué)、微生物學(xué)特別是藥學(xué)領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注[1],海洋微生物胞外多糖的結(jié)構(gòu)及生物活性研究取得了顯著進(jìn)展。

海洋微生物種類數(shù)量繁多,據(jù)統(tǒng)計(jì)有 100 萬～2 億種,在正常海水中的數(shù)量一般為 106/mL,海洋微生物處于低溫、高鹽、高壓、寡營(yíng)養(yǎng)、高溫度梯度及高毒性濃度的特殊環(huán)境,具有產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、功能獨(dú)特的新型活性多糖的潛力,是開發(fā)多糖類海洋新藥的重要資源。幾十年來,已有很多關(guān)于海洋微生物代謝產(chǎn)物的研究文獻(xiàn),但研究目標(biāo)還主要局限于脂溶性小分子化合物的代謝產(chǎn)物,而關(guān)于海洋微生物胞外多糖的研究鮮見報(bào)道。其生物多樣性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過陸地生物的多樣性,遺傳及生理特性與陸地微生物有所不同,且相當(dāng)部分海洋生物活性物質(zhì)是陸地生物所沒有的[3],因此從海洋微生物尋找各種生物活性的多糖及多糖復(fù)合物,是近年來海洋藥物研究的熱點(diǎn)。

研究表明,海洋微生物胞外多糖大多是由多種單糖按照一定比例組成的雜多糖,其中葡萄糖、半乳糖和甘露糖最為常見,另外還含有葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、氨基糖和丙酮酸等。結(jié)構(gòu)的多樣化使得海洋微生物胞外多糖具有許多特殊的理化特性,在醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域具有廣闊應(yīng)用前景。目前,海洋微生物多糖的研究主要集中在海洋細(xì)菌多糖和海洋真菌多糖,而對(duì)海洋放線菌多糖鮮有報(bào)道。海洋細(xì)菌和海洋真菌作為海洋微生物的一個(gè)重要組成部分,能產(chǎn)生許多具有生物活性的胞外多糖,一些細(xì)菌和真菌多糖已經(jīng)被證明具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)和抗氧化活性。本文對(duì)海洋微生物來源的胞外多糖的研究概況進(jìn)行系統(tǒng)的綜述。

1 海洋細(xì)菌產(chǎn)生的胞外多糖

細(xì)菌的胞外多糖包括革蘭氏陰性菌細(xì)胞膜外的多糖成分以及革蘭氏陽性菌的肽聚糖。

1.1 海洋細(xì)菌胞外多糖的結(jié)構(gòu)研究

早在1983年,Boyle等[4]對(duì)源于兩種潮間帶細(xì)菌的胞外多糖進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)兩者均由葡萄糖、半乳糖和甘露糖構(gòu)成,后者還含有丙酮酸。源自海洋沉積物的海洋假單胞菌能產(chǎn)生一種由葡萄糖、N-乙酞葡萄糖胺和 N-乙酞半乳糖胺構(gòu)成的胞外多糖,可以抑制蛋白質(zhì)合成和增加黏附能力,從而保證該菌在惡劣條件下也可以生存。同年,日本的 Umezawa 等[5]從海水、海泥和海草中分離出1083 株海洋細(xì)菌,并從中得到一種新的雜多糖Marinactin,是由葡萄糖、甘露糖和巖藻糖按 7：2：1 的比例組成。

Okutaani等[6]從一種名叫MU-3海洋細(xì)菌中分離出一種酸性胞外多糖。結(jié)構(gòu)分析表明該多糖含有一個(gè)支鏈結(jié)構(gòu)。其主鏈為-3)-β-Galp(1→3)-α-D-Galp(1→6)-β-D-Glcp(1→側(cè)鏈為α-D-Galp(1→4)--D-Glcu(1→。葡萄糖糖醛酸通過C4連在支鏈上,而β-D-半乳糖殘基在主鏈,末端的半乳糖在側(cè)鏈的C6,C4有乙?；〈?/p>

Nicolaus等[7]研究了分離自意大利淺海熱泉的嗜熱海洋細(xì)菌產(chǎn)生的胞外多糖,這些多糖具有復(fù)雜的初級(jí)結(jié)構(gòu)和不同的重復(fù)單元,提取胞外多糖的分子質(zhì)量是3.8×105u,由甘露糖、葡萄糖、半乳糖和甘露糖胺以 1：0.1：trace：trace 的比例構(gòu)成八糖重復(fù)單元。另一胞外多糖的分子質(zhì)量是1.0×106u,單糖組成為半乳糖、甘露糖、氨基葡萄糖和阿拉伯糖,比例是 1：0.8：0.4：0.2。嗜熱菌Bacillus thermantarcticus產(chǎn)生兩種胞外多糖 EPS1和 EPS2。其中 EPS1是由4種不同的α-D-甘露糖和3種不同的β-D-葡萄糖構(gòu)成的具有重復(fù)單元的結(jié)構(gòu)的雜多糖,類似于黃原膠。EPS2是由4種不同的α-D-甘露糖構(gòu)成的甘露聚糖,還含有微量的丙酮酸,分子質(zhì)量為3.0×105u[8]。

20世紀(jì)90年代開始,隨著深海探測(cè)技術(shù)的發(fā)展,對(duì)深海熱泉微生物的研究成為可能。Raguenes[9]從深海水流中分離得到一種嗜溫異氧細(xì)菌 ST716,這種細(xì)菌在葡萄糖的培養(yǎng)基中分泌出一種不同尋常的大分子質(zhì)量的多糖,該多糖含有葡萄糖、甘露糖、丙酮酸酸化的甘露糖、半乳糖及半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸。Rougeaux 研究小組研究了5種從深海分離得海洋細(xì)菌分泌的胞外聚合物,根據(jù)它們的化學(xué)組成和流變學(xué)性質(zhì)說明有 4種不同的多糖,由可變單孢菌Macleodii subsp.fijiensis分泌的多糖與一種商業(yè)多糖黃原多糖相似,3種假可變單孢菌中的兩種產(chǎn)生了相同的多糖。除屬于弧菌gonus細(xì)菌產(chǎn)生的多糖含有一種醛酸己糖胺外,都含有葡萄糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸[10]。從East Pacific Rise深海熱泉提取的由PseudoalteromonasHYD 721產(chǎn)生的胞外多糖的組成和結(jié)構(gòu),研究表明,此胞外多糖由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖和葡萄糖醛酸以2：2：2：0.8：1 的比例組成。通過甲基化、β-消除、選擇性降解糖醛酸、部分降解和 NMR等方法分析,表明它是由一個(gè)支鏈化的8糖重復(fù)單元構(gòu)成[11]。

1.2 海洋細(xì)菌胞外多糖的活性研究

1.2.1 抗腫瘤活性

日本 Umezawa等[5]對(duì)從培養(yǎng)液中分離出的 167株海洋細(xì)菌產(chǎn)生的胞外多糖,進(jìn)行抗腫瘤活性篩選,有6%的多糖有明顯的抗S180活性。雜多糖Marinactin具有顯著抗小鼠 S180實(shí)體瘤活性,抑制率達(dá)79%～90%,并已在日本作為治療腫瘤的佐劑上市。Marinactin 對(duì)攜帶各種哺乳動(dòng)物腫瘤的小鼠,能延長(zhǎng)壽命,顯著增加脾臟抗體形成細(xì)胞和遲緩型超敏性。此外,在體外它能刺激淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化作用,活化巨噬細(xì)胞[12]。

Rashida 等[13]對(duì)一株海綿共附細(xì)菌Celtodoryx girardae胞外多糖EPS對(duì)單純皰疹病(HSV-1)有抑制作用。另有報(bào)道,從海洋弧菌屬提取的胞外多糖具有抗腫瘤活性。小鼠試驗(yàn)糖對(duì)白血病 P388和肉瘤 S180細(xì)胞均有一定的抗性; 另外,該糖還能降低細(xì)胞對(duì)植物凝集素的免疫反應(yīng)。2006年Arena等[14]研究了分離自意大利 Vulcano島淺海熱泉的耐熱菌株Bacillus licheniformis產(chǎn)生的胞外多糖 EPS-1,發(fā)現(xiàn)EPS-1可以削弱人體外圍血液?jiǎn)魏思?xì)胞(PBMC)中HSV-2的復(fù)制,但在細(xì)胞中沒有此作用。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了海洋中存在著大量的獨(dú)特的微生物資源,顯示了其作為抗腫瘤藥物的開發(fā)前景,增強(qiáng)了人們從海洋微生物胞外多糖的研究尋找具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)、高活性的多糖的信心。

1.2.2 免疫調(diào)節(jié)活性

蘇文金等對(duì)分離自廈門海域 177 株細(xì)菌研究表明,胞外粗多糖產(chǎn)量高于3 g/L 占2.26%,高于2 g/L占 3.95%,并從中篩選到能產(chǎn)生具有顯著免疫調(diào)節(jié)活性多糖的微生物[15]。

1.2.3 抗氧化活性

郭守東等[16]從愛德華氏細(xì)菌Edwardsiella tarda分離得到兩種甘露聚糖 ETW1和 ETW2,其分子質(zhì)量分別為29.0 ku和70.0 ku。結(jié)構(gòu)分析表明ETW1和 ETW2二者均是以[→3)-α-D-Manp(1→]為主鏈的7糖重復(fù)單元組成的甘露聚糖,抗氧化活性表明低分子質(zhì)量多糖的抗氧化活性更強(qiáng),ETW1和ETW2清除OH·的EC50分別為1.13 g/L和1.52 g/L。

1.2.4 其他活性

Lee[17]報(bào)道,從濟(jì)州島海洋沉積物中分離到的細(xì)菌產(chǎn)生一種胞外多糖,分子質(zhì)量大于2 000 ku,由半乳糖、葡萄糖、木糖和核糖構(gòu)成,具有良好的乳化性,可用作乳化劑。海洋生物附著弧菌Vibrio alginolyicus產(chǎn)生的胞外多糖由葡萄糖、氨基阿拉伯糖、氨基核糖和木糖構(gòu)成,分子量為 6390 ku,其溶液具有較好的流變性,但對(duì)高溫和強(qiáng)堿不穩(wěn)定[18]。

孟飛飛等[19]從連云港臺(tái)南鹽場(chǎng)采集藻墊,在去除底泥等雜物的藻類層中分離出 5 株不同的細(xì)菌(編號(hào)為A,B,C,D和E),實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示細(xì)菌胞外多糖是構(gòu)成鹽田藻墊膠質(zhì)的重要組成部分,藻墊核心層細(xì)菌 EPS沒有絮凝活性,不能通過絮凝作用促進(jìn)藻墊形成,而具有乳化活性的 EPS 能夠使藻細(xì)胞表面的疏水性下降,從而使藻細(xì)胞的黏附性下降,因而使藻細(xì)胞易從固著物上分離[20]。

2 海洋真菌產(chǎn)生的胞外多糖

2.1 海洋真菌胞外多糖的結(jié)構(gòu)研究

海洋真菌是海洋微生物的一個(gè)重要分支,胡谷平等[21]首次從南海海洋紅樹林真菌(1356號(hào))的菌體中分離純化出兩種新型多糖W11和W21,W11主要是由葡萄糖和半乳糖的摩爾比按3：2比例組成; 胞外多糖 W21主要由葡萄糖、半乳糖還含有少量木糖組成,摩爾比為 45：3.6：1.0,相對(duì)分子質(zhì)量為 3.4×104,糖酸酸含量為35.12%。從南海海洋紅樹林內(nèi)生真菌菌體中分離得到一種胞外多糖(分子質(zhì)量 34 ku),主要由葡萄糖、半乳糖和少量木糖組成,還含有35.12%的葡萄糖醛酸[22]。

孫海紅等[23]從深海真菌Penicilliumsp.F23-2中提取純化得胞外多糖LEPS1-1、LEPS1-2、LEPS-2,結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明 3種胞外多糖均以甘露糖含量為最高,同時(shí)含有少量或微量的葡萄糖和半乳糖。同時(shí)推斷LEPS1-1和LEPS1-2和LEPS-2中存在大量的α-D-甘露吡喃糖,并含有少量的β構(gòu)型葡萄糖糖苷鍵。陳東淼等[24]從海洋真菌2560號(hào)里面分離得到一種新的多糖A2,由巖藻糖、木糖、甘露糖、葡萄糖以及半乳糖組成,它們的摩爾比分別為 2：2：17：5：2。

中山大學(xué)組曾把2508號(hào)真菌的菌體作為多糖的來源,從該菌體中分離到一種新的多糖G-22a,并通過酸水解的方法對(duì)該多糖的單糖組分進(jìn)行了研究。GC /MS研究表明G-22a由鼠李糖、甘露糖和葡萄糖及少量的木糖、核糖醇組成。鼠李糖/甘露糖/葡萄糖的質(zhì)量比約為1：1：2,還含有少量的木糖和核糖醇。

2.2 海洋真菌胞外多糖的活性研究

文獻(xiàn)表明[25-28]：真菌多糖具有免疫調(diào)節(jié)作用,免疫調(diào)節(jié)是大多數(shù)活性多糖的共性,也是它們發(fā)揮抗腫瘤作用的基礎(chǔ)。真菌多糖并不能直接殺死腫瘤細(xì)胞,但卻可以刺激機(jī)體免疫能力,從而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增生的目的。

2.2.1 免疫調(diào)節(jié)活性

體外細(xì)胞毒試驗(yàn)顯示從南海海洋紅樹林真菌(1356號(hào))的菌體中分離純化出的 W21的 HepG2和Bel7402半數(shù)殺傷濃度(IC50)分別為 50 mg/L和 25 mg/L,有一定的細(xì)胞毒作用。體內(nèi)抑瘤試驗(yàn)顯示W(wǎng)21與環(huán)磷酰胺合用,可提高環(huán)磷酰胺的抑瘤率,提高機(jī)體的免疫作用[21]。

2.2.2 抗氧化活性

Yang[29,30]等從中國(guó)黃海沉積物中分離到的絲狀真菌PhomaherbarumYS4108獲得胞外多糖 EPS2,平均分子質(zhì)量為130 ku,由半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、甘露糖和葡萄糖醛酸構(gòu)成,并具有很強(qiáng)的抗氧化活性。

從深海真菌Penicilliumsp.F23-2中提取純化獲得的 3種胞外多糖均表現(xiàn)出了很強(qiáng)的清除羥基自由基、超氧陰離子自由基的能力和抗脂質(zhì)過氧化,并具有一定的還原能力和清除 DPPH自由基的能力,其中胞外多糖LEPS-2表現(xiàn)出了特別顯著的抗氧化能力[23]。

Sun等[31]研究了海洋絲狀真菌胞外多糖EPS2的清除自由基和抗氧化活性。體外實(shí)驗(yàn)顯示,EPS2對(duì)超氧自由基和羥基自由基具有顯著的清除活性,對(duì)人低密度脂蛋白(LDL)的銅催化氧化反應(yīng)具有劑量依賴性抑制作用,并報(bào)道了 EPS2在 H2O2中對(duì)小鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞的保護(hù)作用[32]。

3 海洋放線菌產(chǎn)生的胞外多糖

海洋放線菌作為一類特殊的、具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的微生物,最早報(bào)道成功分離海洋放線菌的例子為1975 年日本東京大學(xué)微生物所Okami 小組從相模海灣(Sagami Bay)沉積物中分離出能產(chǎn)抗生素的放線菌Chainia puropurogenaSS-228[33]。對(duì)海洋放線菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究多集中在脂溶性小分子天然產(chǎn)物方向,考慮到在過去的幾十年中從陸地放線菌中分離到大量的具有重要生物活性的糖類化合物,因此從海洋環(huán)境中分離和篩選放線菌以得到生物活性高的糖類物質(zhì)是很有必要的。目前,關(guān)于海洋放線菌多糖的結(jié)構(gòu)研究國(guó)內(nèi)外很少見報(bào)道,主要集中在對(duì)其活性的研究,研究表明海洋微生物胞外多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗菌和抗氧化等生物活性。

3.1 免疫調(diào)節(jié)活性

蘇文金等[34]對(duì)分離于廈門海區(qū)潮間帶的 996株海洋放線菌胞外多糖產(chǎn)量和體內(nèi)外免疫活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果表明,3.3%的海洋放線菌粗多糖產(chǎn)量大于3 g/dm3; 在粗多糖產(chǎn)量高的海洋放線菌中有 3株菌株的胞外多糖在體內(nèi)外均具有較好的免疫增強(qiáng)活性,其中鏈霉菌(Streptornyceasp.)23～35菌株的胞外多糖具有較高的非特異性、細(xì)胞及體液免疫增強(qiáng)活性。蔡慧農(nóng)等[35]以鏈霉菌2305菌株作為發(fā)酵菌種,建立和優(yōu)化了胞外多糖搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基配方、發(fā)酵工藝及發(fā)酵條件,胞外多糖產(chǎn)量達(dá)到4.58 g/L,轉(zhuǎn)化率達(dá)到6.90%。為該海洋放線菌胞外多糖的大量獲取并對(duì)其作進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)、活性方面的研究提供了便利,也為該胞外多糖的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)提供了必要的基礎(chǔ)。

3.2 抗菌活性

岡見吉郎從日本Tenjin 島的近海泥中分離到一株放線菌,其菌絲呈淺藍(lán)色,Pridhan -Gottlieh’s 基礎(chǔ)培養(yǎng)基里能利用葡萄糖和肌醇作為唯一的碳源。在含海水的培養(yǎng)基里進(jìn)行振蕩培養(yǎng),能產(chǎn)生抗菌物質(zhì)[36]。

3.3 抗氧化活性

作者最近從海洋放線菌THW-7A發(fā)酵液中分離鑒定出兩種胞外多糖WEPS-1和WEPS-2。結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明：WEPS-1的主鏈主要為1→2Man、1→3Man和 1→2,3Man,并且摩爾比近似等于 5：5：3。而WEPS-2 主鏈主要是 1→2Man、1→6Glc、1→3Glc、1→2,3Man和 1→3,6Man。抗氧化活性研究表明：WEPS-1和WEPS-2對(duì)清除超氧陰離子和抗脂質(zhì)過氧化的能力異常顯著,WEPS-1和WEPS-2清除 O2-·的EC50分別為1.13 g/L和0.59 g/L,抗脂質(zhì)過氧化能力測(cè)試中的EC50分別為0.58 g/L和0.43 g/L。

海洋放線菌雖然不是海洋微生物生態(tài)系統(tǒng)中的主要組成部分,但海洋放線菌的多樣性及其代謝產(chǎn)物的獨(dú)特性,暗示了開發(fā)海洋放線菌的巨大潛力,也越來越引起科學(xué)家的重視。

4 展望

目前,屬我國(guó)管轄的海域約300萬km2,有大小島嶼 6 000多個(gè),地理?xiàng)l件差異大,溫度相差懸殊,有著極其豐富的海洋微生物資源,充分利用我國(guó)海洋微生物的資源優(yōu)勢(shì),研究開發(fā)具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的海洋微生物胞外多糖,不僅具有必要性,而且具有美好的產(chǎn)業(yè)化前景。近年來,國(guó)內(nèi)外科學(xué)工作者對(duì)海洋微生物來源的次級(jí)代謝產(chǎn)物胞外多糖的興趣激增。但就世界范圍來說,由于對(duì)海洋微生物的生物學(xué)和生物化學(xué)知識(shí)仍然很缺乏,相當(dāng)數(shù)量的細(xì)菌、真菌和放線菌還沒有被認(rèn)識(shí)和分離,但從已獲得的研究結(jié)果表明,海洋微生物胞外多糖的研究取得了重大進(jìn)展。建立了一系列活性多糖的提取、純化方法、生物活性測(cè)試方法、結(jié)構(gòu)分析方法,發(fā)現(xiàn)了許多具有重要生理活性的胞外多糖,研究的廣度和深度在不斷發(fā)展。綜上所述,海洋里生存繁衍著許許多多新種屬的微生物和特殊生態(tài)系統(tǒng)的微生物,這些海洋微生物有產(chǎn)生多種結(jié)構(gòu)新穎的生物活性物質(zhì)多糖的巨大潛力,必將成為人類開發(fā)新藥的重要寶庫之一。

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