應(yīng)用反相高效液相色譜定性和定量浮游植物光合色素

胡 俊,柳 欣,王 磊,黃邦欽

(1.廈門大學(xué) 福建省海洋環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 海洋與環(huán)境學(xué)院,福建 廈門 361005; 2.華東師范大學(xué) 河口海岸學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200062)

由于葉綠素、類胡蘿卜素等光合色素具備：(1)只有營光合作用的浮游生物細(xì)胞中含有; (2)一些光合色素僅出現(xiàn)于某一類浮游生物; (3)光合色素分子不穩(wěn)定,細(xì)胞死亡后會(huì)迅速分解; (4)不同的光合色素對(duì)可見光的吸收光譜特征不同。因此,光合色素的測(cè)定不僅可以用于指示浮游植物的總生物量,還可作為生物標(biāo)志物,用于指示浮游植物的類群組成、生理狀況[1]、水團(tuán)的特征[2,3]、真光層中的輸出生產(chǎn)力[4]、水質(zhì)狀況[5]及浮游植物原位生長速率等[6],已經(jīng)被國內(nèi)外海洋生態(tài)學(xué)家廣泛接受。隨著矩陣因子化程序CHEMTAX[7]的提出,進(jìn)一步推動(dòng)了光合色素在海洋生態(tài)學(xué)研究中的應(yīng)用。

海水中光合色素的提取、分離、定性和定量分析是應(yīng)用光合色素法準(zhǔn)確評(píng)價(jià)水體中浮游植物生物量及類群組成的前提和基礎(chǔ)。但由于光合色素種類繁多,分子結(jié)構(gòu)差異不大,且對(duì)光、溫、酸堿、氧十分敏感,個(gè)別光合色素還會(huì)形成同分異構(gòu)體,特定海區(qū)特定光合色素濃度較低等特點(diǎn),給光合色素的提取、分離、定性與定量過程帶來較大困難。目前反相高校液相色譜法是國內(nèi)外光合色素的分離、分析的首推方法。借助該方法,國內(nèi)研究者已能將大量的葉綠素及類胡蘿卜素進(jìn)行很好的分離[8-9]。陳紀(jì)新等[10]借助二極管陣列檢測(cè)器(DVD),選擇合理的洗脫程序,能將葉綠素a(Chla)和二乙烯基葉綠素a(DV-Chla)較好地分離。而姚鵬等[11]和朱卓毅[12]在Zapata等[13]方法基礎(chǔ)上做一定修改后,同樣獲得了Chl a和DV-Chl a較好的分離效果。但目前在光合色素的定性、定量方面的專門研究還較少,實(shí)際分析工作中常會(huì)遇到不少問題,比如光合色素濃度與色譜峰面積的轉(zhuǎn)換系數(shù)(fp)不準(zhǔn)確,將無法準(zhǔn)確估算水體中光合色素的實(shí)際濃度,也影響文獻(xiàn)數(shù)據(jù)之間的可比性。作者購買通過藻類單種純培養(yǎng)獲得的高純度光合色素標(biāo)準(zhǔn)品(丹麥 DHI-14C公司),采用 Furuya等[14]的提取方法、在Balow等[15]和陳紀(jì)新等[16]的分離方法基礎(chǔ)上做一定修改后,分析測(cè)定了19種關(guān)鍵的浮游植物光合色素的保留時(shí)間、吸收光譜、最大吸收波長(λmax)、校正曲線及響應(yīng)因子(fp)等參數(shù),并對(duì)影響各參數(shù)的因素進(jìn)行討論與分析,為國內(nèi)同行在相關(guān)領(lǐng)域的研究提供借鑒與參考。

1 材料和方法

1.1 儀器與材料

儀器：Agilent l100 Series液相色譜工作站,結(jié)合二極管陣列檢測(cè)器(DAD),Eclipse XDB C8色譜柱(Agilent,Germany)。

材料：光合色素標(biāo)準(zhǔn)品,從丹麥DHI-14C公司購買,光合色素標(biāo)準(zhǔn)品的名稱(中文名稱、英文名稱及縮寫)、初始濃度及溶解體系如表1所示。

表1 光合色素標(biāo)準(zhǔn)品的名稱、縮寫、濃度及溶解體系Tab.1 The names,abbreviations,concentrations and solvents of the photosynthetic pigments

1.2 方法

1.2.1 洗脫程序

光合色素的高效液相色譜分析流動(dòng)相由A和B組成,其中 A 為V甲醇：V1M乙酸銨=4：1,B 為 100%甲醇。洗脫程序如表2所示。

表2 光合色素HPLC分離分析梯度洗脫程序Tab.2 The linear gradient elution protocol of HPLC-based photosynthetic pigment analysis

1.2.2 響應(yīng)因子測(cè)定

將購得的光合色素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋(至少4個(gè)濃度梯度),測(cè)定不同濃度的譜峰面積(檢測(cè)波長為 440 nm),以光合色素濃度Cp作為 y軸,峰面積 Ap作為x軸,以光合色素濃度和峰面積作散點(diǎn)圖,通過線性回歸得出線性方程(1),其斜率即為響應(yīng)因子(fp)。

1.2.3 定量

各光合色素標(biāo)準(zhǔn)品在不同稀釋濃度下進(jìn)行色譜分析,測(cè)得不同濃度下各色素在440 nm波長的峰面積。利用校正因子fp,根據(jù)公式(2)進(jìn)行光合色素濃度的計(jì)算：

式中,Cs為光合色素質(zhì)量濃度,單位為ng/L;Ap各光合色素洗脫峰的面積,單位為mAU*s;fp為各光合色素濃度與峰面積線性回歸方程的斜率,單位為mg/mAU;vext為進(jìn)行色素抽提時(shí)所用提取液體的體積,單位為10-3L;vfilt為采樣時(shí)過濾海水的體積,單位為10-3L;vinj為高效液相色譜分析時(shí)的進(jìn)樣體積,單位為10-3L; B為緩沖液的稀釋因子。

2 結(jié)果

2.1 光合色素標(biāo)準(zhǔn)品純度的檢驗(yàn)

標(biāo)準(zhǔn)光合色素在運(yùn)輸、保存過程中會(huì)因出現(xiàn)不同程度的降解而純度下降。因此,標(biāo)準(zhǔn)品使用前必須檢驗(yàn)其純度。標(biāo)準(zhǔn)品的純度檢驗(yàn)通過 Chem-station程序完成。具體操作是分段檢測(cè)光合色素標(biāo)準(zhǔn)品在440 nm的吸收峰峰寬范圍內(nèi)的吸收光譜特征,結(jié)果顯示,各光合色素標(biāo)準(zhǔn)品在峰寬范圍內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)的吸收光譜重疊較好,表明標(biāo)準(zhǔn)品純度高。(圖 1a為BUT440 nm的吸收峰,圖1b為BUT在吸收峰的范圍內(nèi)分段檢測(cè)其吸收光譜)。

圖1 光合色素19-丁酰基氧化巖藻黃素的純度檢驗(yàn)Fig.1 Confirmation of the peak purity on the example of 19’-butanoyloxy -fucoxanthin

2.2 光合色素的液相色譜分離

混合標(biāo)準(zhǔn)品的色譜分析情況如圖2所示。在本實(shí)驗(yàn)體系下各種標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間均小于 32 min,表明該方法有較高的樣品分析速率。另外,該方法能將DV-Chla和Chla,LUT和ZEA,Chlb和DV-Chlb等極性差異不大的光合色素較好地分離,但是Chlc1和Chlc2仍然是在同一個(gè)峰中被洗脫出來。

圖2 反相高效液相色譜對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)光合色素的色譜分析圖Fig.2 RP-HPLC chromatograms of mixed photosynthetic pigment standards

2.3 光合色素的吸收譜峰

在本實(shí)驗(yàn)體系下,葉綠素類及類胡蘿卜素類在300～800 nm波長范圍內(nèi)的吸收光譜特征如圖3及圖4所示。葉綠素類均存在兩個(gè)較強(qiáng)吸收峰,其一位于藍(lán)光區(qū)(300～500 nm),另一個(gè)區(qū)域在紅光區(qū)(550～700 nm)。Chla及DV-Chla(圖3e、f)在兩個(gè)區(qū)域的最大吸收波長處的吸收強(qiáng)度相當(dāng),Chlc(圖3a、b)在紅光區(qū)最大吸收波段的吸收強(qiáng)度則明顯弱于藍(lán)光區(qū)。Chlb及DV-Chlb(圖3c、d)在410 nm處存在吸收的相對(duì)低值。因此,根據(jù)吸收光譜特征上的差異完全可以將Chla、b和c區(qū)分開來。

雖然Chla與DV-Chla吸收光譜的形狀非常相似,但它們之間也存在差異(圖3e、f)。Chla在藍(lán)光區(qū)的最大吸收波長為432 nm,而DV-Chla的最大吸收波長紅移了 10 nm,為 442 nm。類似的情況在Chlb與DV-Chlb之間也存在,DV-Chlb的最大吸收波長紅移了8 nm。因此,雖然Chla/b與DV-Chla/b的保留時(shí)間非常接近,憑此差異也完全可以將二者區(qū)分。

圖3 葉綠素類光合色素的光吸收光譜特征Fig.3 Absorption spectra of Chlorophylls

類胡蘿卜素對(duì)可見光的吸收主要在藍(lán)光區(qū),波長范圍在 350～550 nm。在此范圍內(nèi),一般情況下均有 2～3個(gè)吸收峰(圖 4d、g),但是會(huì)因溶劑不同而有所差異。若以Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ表示波長由短至長的三個(gè)吸收峰,Ⅰ和Ⅲ通常會(huì)因發(fā)色基團(tuán)的干擾而形成肩峰,如DIAD、ALL和DIAT等,Ⅰ已經(jīng)形成了肩峰,Ⅲ保留較好(圖4h、i、j)。個(gè)別光合色素的Ⅰ和Ⅲ也會(huì)被Ⅱ完全覆蓋而形成單峰特征,如 PER和CANT(如圖 4a、m)。

與葉綠素類相比,類胡蘿卜素類之間的吸收光譜差異較小,有些光合色素最大吸收波長僅差 1～2 nm。如,PERI和CAN,只有Ⅱ出現(xiàn),且只相差1 nm。而DIAD、ALL和DIAT的Ⅰ均為肩峰,Ⅱ的波長相同,只有Ⅲ有微小的差別。因此,僅憑Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的差異很難將其區(qū)分; 而不同溶劑對(duì)Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的波長也會(huì)有影響,這進(jìn)一步加大了它們之間的定性難度。因此,在定性過程中必須參考光合色素的保留時(shí)間。

2.4 光合色素的定量

各已知濃度的色素標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)過一系列稀釋,并與測(cè)得的440 nm波長的峰面積進(jìn)行線性回歸得出的校正工作曲線如圖 5所示,響應(yīng)系數(shù)(fp),保留時(shí)間及其最大吸收波長如表3所示。

由表可知,不同的光合色素的響應(yīng)系數(shù)差別較大。Chla、Chlb、DV-Chla和PRA的fp值較高,分別為0.417,0.505,0.276和0.25。表明該類光合色素的儀器信號(hào)較弱; 而 Chlc2,FUCO,VIO,DIAD,NEO,ALL,DIAT,ZEA以及β-CAR等fp值較低,其值均低于 0.1; 其他光合色素的fp值介于 0.2和 0.1之間。

3 討論

3.1 光合色素的定性

3.1.1 保留時(shí)間

圖4 利用反相高效液相色譜測(cè)得類胡蘿卜素的光吸收光譜特征Fig.4 Absorption spectra of carotenoids obtained

圖5 標(biāo)準(zhǔn)光合色素的回歸曲線Fig.5 Calibration curves for the photosynthetic pigment standards

保留時(shí)間是對(duì)光合色素進(jìn)行定性的一個(gè)重要參數(shù)。在一定的體系中各光合色素的保留時(shí)間是相對(duì)穩(wěn)定的。但是在進(jìn)行樣品分析時(shí),通常會(huì)發(fā)生保留時(shí)間漂移現(xiàn)象。此現(xiàn)象的發(fā)生可能是環(huán)境溫度、流動(dòng)相、色譜柱性質(zhì)發(fā)生改變產(chǎn)生導(dǎo)致,如流動(dòng)相脫氣過程會(huì)改變流動(dòng)相的氣壓平衡,而且一輪梯度洗脫后固定相極性是否回到初始狀況等均會(huì)使保留時(shí)間改變。因此,進(jìn)行樣品分析前應(yīng)先進(jìn)甲醇空白樣分析,以保證樣品分析前流動(dòng)相氣壓達(dá)到平衡。另外,將分離柱放置在柱恒溫器或水浴中,可達(dá)到穩(wěn)定分析柱溫度(變化范圍＜0.1℃),有利于改善保留時(shí)間漂移現(xiàn) 象。

表3 光合色素標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間、響應(yīng)因子(fp)、相關(guān)系數(shù)及最大吸收波長Tab.3 Retention times,response factors,important coefficients and wavelengths of the absorption maxima of pigments in RP-HPLC analysis

3.1.2 出峰順序

出峰順序是由各光合色素的相對(duì)極性所決定,與提取劑、流動(dòng)相的組成及分析柱的選擇緊密相關(guān),但在一定的體系下是相對(duì)穩(wěn)定的。本研究中HEX的保留時(shí)間短于VIO,因而先被洗脫出峰。而在某些方法中,如Van等[17]的方法中,二者的出峰順序與本研究剛好相反。在Stón等[18]的方法中,HEX的極性變化更大,其峰先于NEO。此外,本研究中ZEA和LUT兩峰的先后順序也與Stón等[18]恰好相反。因此在對(duì)以上這幾個(gè)光合色素的定性時(shí)必須結(jié)合其保留時(shí)間和吸收光譜來加以判斷。另外,光合色素的吸收光譜特征也會(huì)隨分析體系的差異而有所不同。因此,最佳的定性方法是在光合色素標(biāo)準(zhǔn)品的輔助下,獲得自己的分析體系下各種光合色素的保留時(shí)間以及吸收光譜特征。

3.2 光合色素的定量

3.2.1 光合色素標(biāo)準(zhǔn)品的獲得

光合色素標(biāo)準(zhǔn)品的獲得有兩種途徑,其一,從化學(xué)藥品公司購買,如Chla、Chlb和 β-CAR可從Sigma-Aldrich公司購得,ZEA和LUT可以從Roth化學(xué)試劑公司購買。但由于商業(yè)途徑提供的光合色素標(biāo)準(zhǔn)品的種類有限,往往難以滿足對(duì)海洋中主要光合色素的定性、定量需求。雖然丹麥 DHI-14C公司提供了種類較全的光合色素標(biāo)準(zhǔn)品,但其量少(2.5 mL),濃度也不夠高,使得樣品中的光合色素濃度落在工作曲線之外。另外,該標(biāo)準(zhǔn)品一旦拆封后就得立即使用。若拆封后需要保存一段時(shí)間后繼續(xù)使用,則必須確定標(biāo)準(zhǔn)品是否降解,并采用分光光度法重新標(biāo)定濃度。相對(duì)其高昂的價(jià)格,這不是經(jīng)濟(jì)的選擇。其二,利用藻類的純種培養(yǎng)自己制備。利用制備或半制備型 HPLC將需要的光合色素分離純化、收集后用分光光度法,根據(jù)其最大波長處的消光系數(shù)進(jìn)行濃度標(biāo)定,濃度計(jì)算如公式(3)所示：

其中Cd為光合色素質(zhì)量濃度,單位為mg/L,Amax是在最大吸收波長下的吸光值,A750nm表示在750nm處的吸光值,l為比色皿的寬度,E為光合色素在最大吸收波長下的消光系數(shù)[18,19],該值如表4所示。

表4 在一定溶劑下各光合色素在最大吸收波長處的消光系數(shù)Tab.4 Extinction coefficients of pigments at the maximum absorb wavelengths

但是這個(gè)過程較為繁瑣,且必須具備含有目標(biāo)光合色素的藻株。有些特征光合色素含有的藻株在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)較難培養(yǎng)。部分藻株需從美國 Provasoli-Guillard國家海洋藻類培養(yǎng)中心(CCMP)購買。

3.2.2 響應(yīng)因子(fp)

響應(yīng)因子是色譜光電信號(hào)轉(zhuǎn)化成光合色素濃度的關(guān)鍵系數(shù),不同光合色素的響應(yīng)因子不同。將本研究的fp值與文獻(xiàn)值[20]線性相關(guān)性分析,得到線性方程為y=1.045x,R2值為 0.957,且斜率接近 1(圖 6)。但各點(diǎn)的分布雖然靠回歸曲線很近,但并未完全落于線上,表明二者之間仍然有差異,這可能是實(shí)驗(yàn)體系差異導(dǎo)致。Stoń等[18]比較了 LiChroCART Hypersil ODS 和 LiChroCART LiChrospher 100 RP1兩款不同色譜柱在相同的流動(dòng)相及柱溫條件下各種光合色素的響應(yīng)因子的差異,發(fā)現(xiàn)響應(yīng)因子受固定相的影響較大,且變化規(guī)律不同。如,Chlb,采用不同的分離柱測(cè)得其fp值分別為0.427 5和0.600 9,之間相差將近50%; 本研究所得的fp值介于二者之間,為0.505。但采用不同的分離柱測(cè)得的Chla的fp值差別不大,分別為0.445 8和0.414 7; 本研究中Chla的fp為0.417。若使用不同的fp值計(jì)算同一個(gè)樣品時(shí),會(huì)使得Chlb的濃度差別較大,而Chla濃度變化不大。而PRAS與Chlb情況類似。因此,在選用不同類型色譜柱或更換新的色譜柱時(shí),必須重新測(cè)定fp值。另外,高效液相色譜的光源更換、儀器搬運(yùn)也可能會(huì)導(dǎo)致電信號(hào)的波動(dòng),fp會(huì)發(fā)生變化,也需對(duì)其重新測(cè)定。

圖6 fp實(shí)測(cè)值與文獻(xiàn)值之間的的相關(guān)性分析Fig.6 Relationship between the fp tested and the fp from references

4 小結(jié)

利用本實(shí)驗(yàn)室建立的RP-HPLC實(shí)驗(yàn)體系,分析了19種浮游植物常見光合色素標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間、吸收光譜、最大吸收波長、校正曲線及響應(yīng)因子等參數(shù)。結(jié)果顯示,在該實(shí)驗(yàn)體系下,19種光合色素都能夠較好地分離和檢測(cè),但HEX與NEO、PRA之間及LUT和ZEA之間的出峰順序與文獻(xiàn)報(bào)道的其他實(shí)驗(yàn)體系的結(jié)果有所差異。因此,對(duì)以上光合色素進(jìn)行定性時(shí),不但要參考色素的出峰順序、保留時(shí)間,還必須同時(shí)參考色譜峰的吸收光譜特征。另外,通過將本研究獲得的光合色素的響應(yīng)因子(fp)與文獻(xiàn)值進(jìn)行比較,作者發(fā)現(xiàn)不同光合色素的響應(yīng)因子在不同的實(shí)驗(yàn)體系下的變化趨勢(shì)不同。因此,當(dāng)分析實(shí)驗(yàn)體系或儀器狀態(tài)發(fā)生改變時(shí),不能繼續(xù)沿用原先的fp值來計(jì)算光合色素的濃度,而應(yīng)當(dāng)利用光合色素標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)fp進(jìn)行重新測(cè)定。

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