丙丁酚對高糖環(huán)境下人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及VEGF表達(dá)的影響

李 梅 彭輝燦

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病晚期的嚴(yán)重并發(fā)癥之一。視網(wǎng)膜新生血管(retinal neovascularization，RNV)的形成是其主要致盲因素，預(yù)防RNV的形成至關(guān)重要。已有研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在新生血管生成中是必不可少的重要誘導(dǎo)因子［1］。丙丁酚(普羅布考，Probucol)在20世紀(jì)70年代作為一種降脂藥物應(yīng)用于臨床［2］，具有抗氧化、抗炎、抑制內(nèi)膜增生和血管重構(gòu)及改善內(nèi)皮細(xì)胞功能的作用。本研究觀察丙丁酚對于體外培養(yǎng)的高糖環(huán)境下人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞(human retinal capillary endothelial cells，HRCEC)增殖抑制及VEGF表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 丙丁酚(美國Sigma公司);胰蛋白酶(美國Sigma公司);胎牛血清(杭州四季青公司);DMEM培養(yǎng)液(武漢博士德公司);噻唑藍(lán)(MTT)和二甲基亞砜(DMSO;AMRESCO公司);兔抗人Ⅷ因子IgG、兔抗人VEGF-IgG、免疫細(xì)胞化學(xué)試劑盒、DAB試劑盒(武漢博士德公司);培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、眼科器械。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HRCEC培養(yǎng) 取材于手術(shù)室角膜移植術(shù)后新鮮人眼球，參考文獻(xiàn)［3-4］的培養(yǎng)方法進(jìn)行HRCEC原代培養(yǎng)。將培養(yǎng)瓶置于37℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，每2 d換液1/3～1/2，待細(xì)胞長滿瓶底約80%，按1∶2傳代。

1.2.2 HRCEC鑒定 相差顯微鏡觀察細(xì)胞的生物學(xué)形態(tài)特征，將蓋玻片放入6孔板內(nèi)，細(xì)胞爬片后，運(yùn)用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測第Ⅷ因子相關(guān)抗原抗體，顯微鏡下觀察其表達(dá)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為以下7組:0組:不加細(xì)胞只加培養(yǎng)基的調(diào)零組;GL組:低糖對照組;G0組:高糖對照組;G1組:高糖+5 μmol·L－1丙丁酚組; G2組:高糖+10 μmol·L－1丙丁酚組;G3組:高糖+ 20 μmol·L－1丙丁酚組;G4組:高糖+40 μmol·L－1丙丁酚組;G5高糖+80 μmol·L－1丙丁酚組。丙丁酚作用時間均為24 h。高糖的葡萄糖濃度為25 mmol·L－1，低糖的葡萄糖濃度為5.5 mmol·L－1。

1.2.4 MTT檢測HRCEC的增殖 取生長良好的第3－4代HRCEC用于實(shí)驗(yàn)。棄培養(yǎng)基，PBS洗2次，2.5 g·L－1胰酶消化，加含體積分?jǐn)?shù)20%胎牛血清高糖或低糖DMEM培養(yǎng)液，分別制成高糖和低糖細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為60×106L－1，加入96孔板中，高糖共6組，低糖1組，以及調(diào)零組1組，每組6個復(fù)孔，每孔180 μL。將96孔板置于37℃、含體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，24 h待細(xì)胞貼壁后G1～G5組分別加20 μL不同濃度丙丁酚，使丙丁酚終濃度分別為5 μmol·L－1、10 μmol·L－1、20 μmol·L－1、40 μmol· L－1、80 μmol·L－1。培養(yǎng)20 h后，每孔加5 g·L－1MTT液20 μL，培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，棄培養(yǎng)基，用濾紙吸干水分，每孔加150 μL DMSO原液，振蕩10 min，待藍(lán)紫色結(jié)晶完全溶解后，用自動酶標(biāo)儀570 nm波長測吸光度A值。上述條件下重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率=［1－(實(shí)驗(yàn)組A值－空白組A值)/ (對照組A值－空白組A值)］×100%。

1.2.5 免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測VEGF的表達(dá) 將消毒滅菌并標(biāo)記好的醫(yī)用蓋玻片放入無菌的6孔板中，制作密度為60×106L－1的HRCEC懸液，每孔2 mL，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后分為5組。分別為低糖對照組GL:含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清低糖DMEM培養(yǎng);高糖對照組G0:含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清高糖DMEM培養(yǎng);高糖加藥組G1、G4、G5:含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清高糖DMEM培養(yǎng)+終濃度分別為5 μmol·L－1、40 μmol·L－1、80 μmol·L－1丙丁酚組，每組2個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，取出蓋玻片，PBS液洗滌，40 g·L－1多聚甲醛室溫固定20 min，體積分?jǐn)?shù)3%H2O2-甲醇封閉內(nèi)源性過氧化物酶，PBS液洗滌后加入兔抗人VEGF-IgG一抗(1∶100)，另一復(fù)孔加入PBS液，4℃過夜，PBS液洗滌，SABC法染色，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。梯度酒精脫水，中性樹脂封片。以PBS液代替一抗為陰性對照。陽性染色為細(xì)胞內(nèi)棕黃色顆粒。對各組進(jìn)行灰度值測定，以背景灰度值與陽性灰度值之差作為每組灰度值。

2 結(jié)果

2.1 HRCEC的培養(yǎng)與鑒定 在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài):HRCEC呈現(xiàn)鋪路石樣單層貼壁生長(圖1)。運(yùn)用免疫細(xì)胞化學(xué)方法鑒定:經(jīng)第Ⅷ因子相關(guān)抗原抗體染色，HRCEC胞漿中有棕黃色著色(圖2)，陰性對照組無著色，均證實(shí)體外成功培養(yǎng)出HRCEC。

2.2 MTT檢測丙丁酚對HRCEC增殖的影響MTT比色法檢測顯示不同濃度丙丁酚處理對數(shù)生長期的HRCEC培養(yǎng)24 h，在相同培養(yǎng)時間條件下，低糖對照組與高糖對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1，P=0.067＞0.05)。不同濃度丙丁酚對HRCEC增殖有明顯抑制作用，隨著丙丁酚濃度的逐漸提高，細(xì)胞存活率逐漸下降，而細(xì)胞抑制率逐漸升高。含不同濃度丙丁酚組吸光度A值明顯降低，與高糖對照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0.05)，并且含不同濃度丙丁酚組中各組之間兩兩比較差異亦均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0.05)。

Figure 1 HRCEC fused into cobblestone-like single layer HRCEC融合成單層，猶如鋪路石

Figure 2 Primary cultured HRCEC showed positive staining forⅧmonoclonal antiboby 原代培養(yǎng)的HRCECⅧ因子抗體染色陽性

表1 丙丁酚對HRCEC增殖的影響Table 1 Effect of probucal on proliferation of HRCEC (s，n=6)

表1 丙丁酚對HRCEC增殖的影響Table 1 Effect of probucal on proliferation of HRCEC (s，n=6)

Group A570Inhibiting rate/% 0 0.101 5±0.009 4 / GL 0.917 2±0.011 6 / G0 0.931 7±0.012 3 / G1 0.862 8±0.011 1 8.40 G2 0.760 8±0.010 3 20.84 G3 0.645 5±0.022 1 34.90 G4 0.560 0±0.010 9 45.32 G50.477 5±0.010 6 55.38

2.3 丙丁酚對HRCEC中VEGF表達(dá)的影響

2.3.1 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測結(jié)果 VEGF定位于胞膜和胞漿，陽性部分為棕黃色顆粒，低糖對照組、高糖對照組與高糖+丙丁酚濃度分別為5 μmol·L－1、40 μmol·L－1、80 μmol·L－1作用于HRCEC 24 h，免疫細(xì)胞化學(xué)背景灰度值與陽性灰度值之差分別為28.75±3.77、71.93±8.37、54.67±4.33、41.43± 3.45、29.18±3.37。與高糖對照組相比，加藥組作用24 h VEGF表達(dá)明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3-圖5，均為P＜0.05)，且呈質(zhì)量濃度依賴性，胞漿內(nèi)陽性顆粒隨著藥物作用濃度的增加而減少，顏色逐漸變淡。與低糖對照組相比，高糖對照組VEGF的表達(dá)明顯增加(P＜0.05)，胞膜及胞漿內(nèi)陽性顆粒較密集，顏色較深。

Figure 3 Expression of VEGF in HRCEC in high glucose group高糖對照組HRCEC中VEGF的表達(dá)

Figure 4 Expression of VEGF in HRCEC in 40 μmol·L－1probucal+high glucose group 高糖+40 μmol·L－1丙丁酚組HRCEC中VEGF的表達(dá)

Figure 5 Expression of VEGF in HRCEC in high glucose+80 μmol·L－1probucal group 高糖 +80 μmol·L－1PBC組HRCEC中VEGF的表達(dá)

3 討論

DR是糖尿病微血管病變的重要并發(fā)癥之一，發(fā)病機(jī)制目前并不完全清楚。目前認(rèn)為，高血糖除通過經(jīng)典的多元醇途徑、糖基化終末產(chǎn)物(AGE)途徑、蛋白激酶C(PKC)途徑和己糖胺途徑促進(jìn)DR的進(jìn)展外，多種細(xì)胞因子如VEGF、HIF-1、腫瘤壞死因子等在糖尿病新生血管形成中起作用［5］。增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy，PDR)是DR致盲的主要原因，新生血管是其標(biāo)志性的病理改變。在PDR患者房水或玻璃體液中，促血管新生因子水平如VEGF、細(xì)胞因子、生長因子等顯著升高［6-8］，其中VEGF可能起著最關(guān)鍵的作用［8］。研究表明，VEGF具有促進(jìn)血管通透性增加、導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)變性、誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移增殖和血管形成等作用［9］，而血管內(nèi)皮細(xì)胞的活動是新生血管形成的中心環(huán)節(jié)，任何體內(nèi)體外的因素作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞都可以影響血管新生的過程。相應(yīng)的治療如激光光凝、經(jīng)瞳孔光動力學(xué)治療及玻璃體手術(shù)等，雖有一定的療效，但同時存在許多不良反應(yīng)和局限性［10-12］。研究表明，單獨(dú)滅活VEGF即可廣泛抑制生理性和病理性新生血管形成［13］。因此，抗血管新生因子尤其是抗VEGF及其受體的研究具有很大意義［8］。

丙丁酚是臨床常用的降脂藥，其藥理學(xué)作用: (1)具有顯著降低血漿膽固醇并促進(jìn)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn); (2)抗氧化作用:丙丁酚除能有效抑制低密度脂蛋白和高密度脂蛋白的氧化外，Iqbal等［14］發(fā)現(xiàn)丙丁酚能有效抑制微粒體膜脂質(zhì)過氧化DNA損傷;(3)改善內(nèi)皮功能，選擇性抑制黏附因子表達(dá)、減少細(xì)胞間黏附［15］;(4)抗炎作用:丙丁酚能夠通過減少巨噬細(xì)胞分泌白介素-1(interleukin-1，IL-1)和腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor-α，TNF-α)的表達(dá)，抑制黏附分子的表達(dá)［16］;(5)抑制內(nèi)膜增生和血管重構(gòu)，Tanous等［17］實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，丙丁酚通過促進(jìn)內(nèi)膜重建，能夠有效地抑制支架內(nèi)的血栓形成;(6)丙丁酚和胰島素聯(lián)合應(yīng)用，可顯著提高胰島素的治療效果和降低并發(fā)癥的發(fā)生［18］。本實(shí)驗(yàn)將丙丁酚作用于體外培養(yǎng)的高糖下HRCEC，觀察其對HRCEC細(xì)胞增殖和VEGF表達(dá)的影響。通過MTT比色法檢測不同濃度的丙丁酚作用24 h對原代培養(yǎng)的HRCEC的增殖抑制，結(jié)果表明丙丁酚對高糖下HRCEC增生抑制率呈明顯的質(zhì)量濃度依賴趨勢。免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測正常低糖及不同濃度的丙丁酚作用下的高糖下的HRCEC中 VEGF的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高糖條件下HRCEC中VEGF的表達(dá)明顯增加，丙丁酚能下調(diào)高糖下HRCEC中VEGF表達(dá)，濃度為5 μmol·L－1時起作用，到達(dá)80 μmol·L－1時下調(diào)作用明顯。我們推測丙丁酚抑制高糖下HRCEC的增殖可能是通過下調(diào) VEGF的表達(dá)而發(fā)生作用。但丙丁酚下調(diào)VEGF表達(dá)的信號通路及具體作用調(diào)控點(diǎn)尚待進(jìn)一步研究。

綜上所述，丙丁酚能抑制高糖下HRCEC的增殖并下調(diào)其VEGF的表達(dá)，丙丁酚對預(yù)防RNV的形成、發(fā)展具有重要的積極意義。

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