肽?；彼崦搧啺访?基因多態(tài)性與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及抗環(huán)瓜氨酸化蛋白抗體的相關(guān)性研究*

崔劉福，袁 偉，楊文浩，舒 榮，宋海澄，韓依軒，于 萍，王 建，王潔蕊

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種累及周圍關(guān)節(jié)為主的多系統(tǒng)性炎癥性自身免疫病。它的一個(gè)顯著特點(diǎn)就是血清中存在多種抗體，抗環(huán)瓜氨酸化肽(CCP)抗體的研究是近年來(lái)診斷RA的重大進(jìn)展，其特異性明顯優(yōu)于類風(fēng)濕因子(RF)，并可以與RF同時(shí)檢測(cè)，提高RA的診斷率。很多研究表明，抗瓜氨酸化抗原肽可能參與了RA的發(fā)病，其產(chǎn)量可能影響RA局部炎癥的發(fā)展。對(duì)蛋白質(zhì)瓜氨酸化過(guò)程的研究發(fā)現(xiàn)，肽?；彼崦搧啺访?PADI)是瓜氨酸化抗原肽產(chǎn)生的主要因素，它主要負(fù)責(zé)將精氨酸殘基轉(zhuǎn)化為瓜氨酸。2003年，Suzuki等發(fā)現(xiàn)，PADI4基因多態(tài)性與 RA的易感性有關(guān)，PADI4的SNP變異可影響PADI轉(zhuǎn)錄物的穩(wěn)定性，從而影響抗瓜氨酸化抗原肽抗體的水平，但隨后在英國(guó)、法國(guó)、阿根廷和北美等國(guó)家和地區(qū)的研究并沒(méi)有得出一致的結(jié)論。RA屬于中醫(yī)“痹證”范疇。國(guó)內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)，不同證型RA患者基因表達(dá)和抗-CCP抗體(anti cyclic citrullinated peptide antibody，anti-CCP)水平存在差異，提示不同基因差異可能與RA的中醫(yī)證型有關(guān)。本研究選擇河北地區(qū)134例RA患者和140例健康對(duì)照，分別檢測(cè)了padi4_94位點(diǎn)的SNP和抗 CCP抗體滴度，以探討 PADI基因在RA發(fā)病機(jī)制中的重要作用。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2007年10月至2009年10月在河北唐山開(kāi)灤醫(yī)院住院的134例病人作為病例組，診斷均符合1987年ACR制定的RA分類診斷標(biāo)準(zhǔn)，其中女性87例，年齡21歲 ～82歲，平均年齡51.31歲 ±13.56歲;男性47例，年齡18歲 ～80歲，平均年齡48.17歲±13.41歲，病程從6個(gè)月到20年。均排除系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性肌炎/皮肌炎、系統(tǒng)性硬化等結(jié)締組織病和脊柱關(guān)節(jié)病及感染、腫瘤等疾病。健康對(duì)照組為140例健康體檢人員，女性101例，平均年齡53.63歲 ±13.77歲;男性39例，平均年齡51.72歲±11.87歲，2組間性別、年齡比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

1.2 方法

1.2.1 血標(biāo)本的采集 對(duì)照組及病例組均清晨空腹8h后，取肘前靜脈血3ml加2%乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，置－20℃保存血樣。

1.2.2 DNA的提取 以酚-氯仿法提取外周血基因組DNA，另取抗凝血4ml 3000p/min離心10min分離血清，取上層血清置EP管中－20℃保存。

1.2.3 引物設(shè)計(jì) 檢索Genebank獲得padi4_94位點(diǎn)(rs2240340)基因序列，設(shè)計(jì)引物序列，目的基因上游引物序列為:5’-CCTCTGACCA CACCTG TTCC-3’;下游引物 5’-TCGAACCTCTCAT TGTGG TG-3’。

1.2.4 PCR-LDR方法檢測(cè)SNP PCR擴(kuò)增儀(PERKIN ELMER Gene Amp PCR system 9600)擴(kuò)增基因組 DNA，反應(yīng)體系為 20μl，含基因組 DNA1μl，d NTP2μl，引物各 0.4μl，1 × bμffer2μl，Mg2+2.4μl，TaqDNA聚合酶 0.2μl。反應(yīng)參數(shù)為:95℃預(yù)變性15min，94℃ 變 性 30s，60℃ 退 火 90s，72℃ 延 伸 1 min，35次循環(huán)，72℃延伸7 min。3%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀察PCR產(chǎn)物的效果，PCR反應(yīng)結(jié)束后，在LDR儀(PE9600)進(jìn)行PCR產(chǎn)物的連接酶檢測(cè)反應(yīng)，LDR反應(yīng)體系為 10μl，含位點(diǎn)特異性探針 1μl，PCR 產(chǎn)物≥1μl，LDR 反應(yīng) bμffer 1μl，連接酶 0.05 μl(上海翼和公司)。LDR反應(yīng)參數(shù)為:95℃預(yù)變性 2min，94℃30s，50℃ 2 min，35 次循環(huán)。然后對(duì)LDR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序儀(ABI 377)分析，并對(duì)測(cè)序儀結(jié)果做數(shù)據(jù)分析，得SNP位點(diǎn)基因型分型結(jié)果。

1.2.5 抗CCP抗體的檢測(cè) 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自英國(guó)(Axis-Shield Diagnostics Limited Anti-CCP ELISA)，嚴(yán)格按照操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，卡方檢驗(yàn)分析基因型和等位基因頻率在RA組和健康對(duì)照組2組之間是否存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異，分別采用卡方檢驗(yàn)和Mann-Whitney U檢驗(yàn)比較不同等位基因與抗CCP抗體的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 padi4_94基因型與等位基因頻率的分布

表1顯示，RA病例組和健康對(duì)照組中padi4_94位點(diǎn)的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(P＞0.05)，表明樣本具有群體代表性。各基因型頻率分布在病例組與健康對(duì)照組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.035)。在所有病例、對(duì)照人群中攜帶AG基因型者患RA的可能性是GG基因型的2.010倍(OR=2.010，95%CI=1.162 －3.476)，且攜帶 A等位基因與RA存在相關(guān)性(OR=1.434，95%CI=1.022-2.014，P=0.037)。

2.2 padi4_94位點(diǎn)A等位基因與RA患者中抗CCP抗體的相關(guān)性

表2顯示，以5U/ml作為抗CCP抗體的診斷界點(diǎn)，比較攜帶RA易感等位基因A陽(yáng)性組和陰性組中抗CCP抗體的陽(yáng)性率，2組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(X2=7.688，P=0.006)，其中陽(yáng)性組中抗CCP抗體的陽(yáng)性率高于陰性組。A等位基因陽(yáng)性組的抗CCP抗體滴度明顯高于陰性組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.023)。

表1 padi4_94位點(diǎn)基因型及等位基因頻率在病例組和對(duì)照組中的分布

表2 抗CCP抗體陽(yáng)性/陰性與A等位基因相關(guān)

3 討論

RA的病因復(fù)雜，多基因和環(huán)境因素的共同作用誘發(fā)病理性自身免疫反應(yīng)，導(dǎo)致RA的破壞性多關(guān)節(jié)炎和多種關(guān)節(jié)外炎癥表現(xiàn)?？构习彼犭目贵w(anti-CCP)是目前所發(fā)現(xiàn)的對(duì)RA特異性最高的抗體，而在抗瓜氨酸肽抗體形成中具有關(guān)鍵作用的肽?；彼崦搧啺访?PADI)成為RA病因?qū)W研究的熱點(diǎn)。日本學(xué)者 Suzuki等［1］研究發(fā)現(xiàn)，PADI4基因padi4_94位點(diǎn)SNP與RA有很強(qiáng)的相關(guān)性，且該位點(diǎn)SNP可影響PADI4酶的產(chǎn)量，這提示PADI基因與RA的密切相關(guān)性，因此我們選擇 padi4_94位點(diǎn)作為研究對(duì)象，以探討PADI4基因在RA發(fā)病機(jī)制中的重要作用，同時(shí)檢測(cè)病例組的抗CCP抗體滴度，分析PADI4基因SNP與抗CCP抗體之間的相關(guān)性。

國(guó)內(nèi)學(xué)者［2］對(duì)于 RA中醫(yī)證候與抗 CCP抗體的相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)，不同證候的RA患者中以濕熱阻絡(luò)型抗-CCP抗體最高，提示中醫(yī)分型具有分子水平的基礎(chǔ)。同時(shí)多個(gè)研究［3、4］表明，RA不同證候間的基因表達(dá)譜存在差異，該差異與RA患者和正常人之間有所不同，也與RA患者穩(wěn)定期和活動(dòng)期之間的基因表達(dá)譜不同，提示RA中醫(yī)證候分類學(xué)具有基因表達(dá)譜依據(jù)。因此，可影響功能基因表達(dá)的單核甘酸多態(tài)性也可能是中醫(yī)證候分類學(xué)的基礎(chǔ)。

目前認(rèn)為，PADI4基因是抗CCP抗體形成的關(guān)節(jié)。PADI4作為PADI酶家族的一個(gè)亞型，都能將蛋白質(zhì)肽鏈中的精氨酸殘基催化轉(zhuǎn)化為瓜氨酸殘基。目前PADI4與RA的相關(guān)性已獲得公認(rèn)，其可能的機(jī)制是:PADI4mRNA在炎癥過(guò)程中浸潤(rùn)到滑膜細(xì)胞的嗜中性粒細(xì)胞中迅速轉(zhuǎn)錄和翻譯，進(jìn)而PADI4酶將滑膜中的蛋白催化產(chǎn)生瓜氨酸肽。這種瓜氨酸化使自身表位發(fā)生改變，外周淋巴細(xì)胞可以識(shí)別瓜氨酸化的自身表位，一旦針對(duì)一個(gè)自身蛋白修飾位點(diǎn)的自身免疫建立起來(lái)，免疫系統(tǒng)將識(shí)別自身抗原隱蔽的抗原決定簇，使自身抗原不斷受到新的攻擊，疾病遷延不愈并不斷加重。研究表明，在RA 滑液的巨噬細(xì)胞中有大量的表達(dá)［5］，Shi J 等［6］］的研究證明PADI4可以提高瓜氨酸化抗原肽的水平。這些研究證實(shí)了上述機(jī)制，且表明PADI4在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者抗瓜氨酸化抗原肽的形成中具有決定性的作用。

本研究結(jié)果顯示，padi4_94SNP位點(diǎn)與RA易感性之間存在相關(guān)性，A等位基因可能為RA的易感基因，這與日本的報(bào)道相一致，其基因型分布也與日本人群的基因型分布結(jié)果類似。但是關(guān)于PADI4SNP位點(diǎn)與RA易感性之間的關(guān)系并未獲得一致的結(jié)果，英國(guó)［7］、阿根廷［8］和一個(gè)法國(guó)［9］人群的研究提示了陰性結(jié)果。這些報(bào)道認(rèn)為，PADI4基因SNP與RA無(wú)關(guān)，這可能與不同人群種族內(nèi)的遺傳異質(zhì)性有關(guān)。但即使在歐洲人群中的研究［10］也存在陽(yáng)性的結(jié)果，提示種族的影響并不是導(dǎo)致差異的主要原因。另外，RA是一種復(fù)雜的多基因遺傳病，是由許多微小基因和環(huán)境因素共同作用導(dǎo)致的結(jié)果，在環(huán)境因素中，寒冷、潮濕、外傷等常為本病的誘發(fā)因素，因此PADI4基因只有在一定的環(huán)境因素下才可能對(duì)RA的發(fā)病存在易感性。由于各地區(qū)的環(huán)境因素不盡相同，因此可能導(dǎo)致不同地區(qū)的研究結(jié)果的不一致性。同時(shí)其他遺傳基因的變異也可能影響 PADI4基因?qū)?RA的易感性，對(duì) RA易感的PADI4功能型單倍體可能被其他基因中的某等位基因修飾。含有精氨酸或瓜氨酸的肽鏈可與HLADRB1的8個(gè)變異體相互作用，其中 HLA-DRB1*0401變異體對(duì)瓜氨酸化肽的免疫親和力最高，并激活CD4+T細(xì)胞，因此推測(cè)RA發(fā)病機(jī)制中 PADI4受到HLA-DRB1變異體的影響。多個(gè)研究結(jié)果提示，PADI4與HLA-DRB基因的連鎖可能是其影響類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎易感性之的原因［11～13］。但不同種族之間的HLA基因具有差異，這可能導(dǎo)致了結(jié)果的不一致性。

我們隨后檢測(cè)了病例組抗CCP抗體的滴度，并分析了PADI4基因SNP與抗CCP抗體之間的相關(guān)性。研究認(rèn)為，無(wú)論是應(yīng)用滴度的連續(xù)變量分析方法，還是根據(jù)診斷閾值判定的二分類變量分析方法，都發(fā)現(xiàn)兩者之間存在相關(guān)性，攜帶RA易感等位基因A的患者抗CCP抗體的陽(yáng)性率較高，且其抗CCP抗體的滴度相對(duì)較高，這與日本的研究一致。而我們的研究從DNA水平上驗(yàn)證了Suzuki的觀點(diǎn)，這說(shuō)明PADI4基因SNP影響基因表達(dá)，導(dǎo)致體內(nèi)PADI4產(chǎn)生增多，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)廣泛瓜氨酸化。

本文結(jié)果表明，PADI4基因是與河北漢族人群RA發(fā)病相關(guān)的一個(gè)易感基因，且PADI4基因與瓜氨酸化肽相關(guān)性的研究結(jié)果，為探索RA的發(fā)病機(jī)制提供了理論依據(jù)和新線索。進(jìn)一步分析PADI4基因多態(tài)性與不同中醫(yī)證候型的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎關(guān)系，可能會(huì)發(fā)現(xiàn)更多中醫(yī)分析的理論基礎(chǔ)，為RA的治療開(kāi)辟新的途徑。

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