苦參堿對(duì)低鈣誘發(fā)豚鼠心律失常的電生理影響*

王雪芳，劉艷明

心律失常是心血管領(lǐng)域常見的多發(fā)病。低鈣血癥是導(dǎo)致心肌細(xì)胞電生理異常所引發(fā)特發(fā)性心律失常的常見原因之一。雖然隨著射頻消融以及起搏器植入研究和技術(shù)的不斷進(jìn)步，對(duì)流出道所引發(fā)的抗心律失常領(lǐng)域的治療策略得到更大的拓展和優(yōu)化，但是傳統(tǒng)的藥物治療仍然是抗心律失常治療的主導(dǎo)和基石。中藥苦參是豆科槐屬植物苦參的干燥根，性寒、味苦，入心、脾、腎三經(jīng)，史載于我國最早的藥學(xué)文獻(xiàn)《神農(nóng)本草經(jīng)》，謂其“主心腹積氣，徵瘕積聚”，能“安五臟，定志益精”?！侗静萁?jīng)百種錄》稱“此以味治也，苦入心，寒除火，故苦參專治心經(jīng)之火”。隨著分離提取技術(shù)的進(jìn)步，已發(fā)現(xiàn)其主要成分為苦參堿。多種資料表明，該中藥對(duì)多種原因?qū)е碌男穆墒С＞辛己玫姆乐涡Ч?～3］，但對(duì)其作用機(jī)制的研究鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用常規(guī)的玻璃微電極細(xì)胞內(nèi)記錄技術(shù)，觀察苦參的主要有效成分苦參堿對(duì)低鈣誘發(fā)豚鼠左心室流出道心律失常的電生理作用，對(duì)進(jìn)一步利用中藥優(yōu)勢(shì)，挖掘中藥潛力具有非常重要的臨床意義和實(shí)用價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

選用0.25kg～0.5kg豚鼠，雌雄不拘，中國人民解放軍醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育中心提供。

1.2 藥品和試劑

K-H液試劑均為國產(chǎn)分析純。實(shí)驗(yàn)藥物苦參堿購于北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司(批準(zhǔn)文號(hào)國藥準(zhǔn)字H20030734)。

1.3 主要儀器

電刺激器(SEM-7203，日本光電);微電極放大器(MEZ-8300，日本光電);隔離器(SS-202J，日本光電);多導(dǎo)生理記錄儀(RM-6000，日本光電);RM-6240C型多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)(成都儀器廠);Langendorff離體心臟灌流裝置(LGF-1B成都儀器廠);記憶示波器(VC-11，日本光電)。

1.4 溶液

O2飽和改良 K-H液，離子成分為(g/L):NaCl 69，KCl 3.5，CaCl22.8，MgCl21.4，NaHCO321，KH2PO 4 1.6，Glucose 1.4。取10倍濃度的 NaCl母液及 KCl、CaCl2、MgCl2、NaHCO3、KH2PO4混合母液各100ml，加蒸餾水定容至1000ml混勻，以NaOH調(diào)節(jié)PH值至7.2～7.4，然后加入Glucose 1.4g。配制好的營養(yǎng)液(NaCl 0.118mol/L，KCl 0.47 ×10－2mol/L，CaCl20.25 × 10－2mol/L，MgCl20.12 × 10－2mol/L，NaHCO30.18 × 10－2mol/L，KH2PO40.12 ×10－2mol/L，葡萄糖 0.8 ×10－2mol/L，pH 7.2 ～7.4)當(dāng)天使用。

1.5 標(biāo)本制備

將豚鼠擊顱致昏后迅速開胸取出心臟，經(jīng)冠狀動(dòng)脈沖洗后，從主動(dòng)脈瓣的左瓣與后瓣之間剪開主動(dòng)脈壁，并向下將心室剪開，各瓣膜要保留完整，并以此為寬度，向下切取長(zhǎng)約4mm的心肌組織(含左心室流出道組織)，去除多余脂肪制成實(shí)驗(yàn)標(biāo)本。制好的標(biāo)本用不銹鋼針固定于灌流槽內(nèi)的硅橡膠上，不可過分牽拉標(biāo)本，用K-H液以10ml/min進(jìn)行恒速灌流，灌流液中充以純氧，溫度維持在36℃ ±0.5℃。標(biāo)本在灌流液中穩(wěn)定20min后開始實(shí)驗(yàn)。

1.6 過程與分組

玻璃微電極充以3mol/L KCL電極液后直流電阻為10～20Ω。使用刺激器引導(dǎo)出細(xì)胞的動(dòng)作電位，使微電極穩(wěn)定于左心室流出道同一細(xì)胞內(nèi)，記錄其動(dòng)作電位圖形。如能記錄到自發(fā)電位，則不再進(jìn)行電刺激;若記錄不到自發(fā)電活動(dòng)，則將刺激電極置于遠(yuǎn)離瓣膜一端的心肌組織上，給予波寬2ms、主周期300-500ms、2倍于閾強(qiáng)度的方波刺激，刺激時(shí)間由數(shù)秒至數(shù)分不等，直至誘發(fā)出穩(wěn)定的自發(fā)節(jié)律，停止電刺激，自發(fā)節(jié)律穩(wěn)定后開始實(shí)驗(yàn)。由玻璃微電極引導(dǎo)出的動(dòng)作電位，經(jīng)MEZ-8300微電極放大器放大后，一路輸至VC-11記憶示波器進(jìn)行觀察，另一路經(jīng)RM-6240C型多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)輸入計(jì)算機(jī)，實(shí)時(shí)記錄分析動(dòng)作電位的各項(xiàng)參數(shù)指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)分為3組。正常對(duì)照組用O2飽和的改良K-H液恒溫、恒速灌流，穩(wěn)定后記錄20min后各項(xiàng)參數(shù);低鈣血癥組加入低鈣灌流液(NaCl 0.118mol/L，KCl 0.47 ×10－2mol/L，CaCl20.125 ×10－2mol/L，MgCl20.12 × 10－2mol/L，NaHCO30.18 × 10－2mol/L，KH2PO40.12×10－2mol/L葡萄糖0.8×10－2mol/L，pH 7.2 ～7.4)灌流，觀察記錄 5min、10min、20min 時(shí)各項(xiàng)參數(shù);低鈣血癥 +苦參堿組，在低鈣灌流液50ml中加入苦參堿 5ml(50μmol/l)，觀察并記錄20min時(shí)各項(xiàng)參數(shù)。

1.7 觀測(cè)指標(biāo)

最大舒張電位(maximal diastolic potential，MDP)，動(dòng)作電位 0相幅值(amplitude of action potential，APA)，4相自動(dòng)去極速度(maximal rate of depolarization，Vmax)，舒張期除極速率(velocity of diastolic depolarization，VDD)，復(fù)極50%和90%時(shí)間(50%and 90%of duration of action potential，APD50and APD90)，自發(fā)放電頻率(rate of pacemaker firing，RPF)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用Excel統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行，動(dòng)作電位各觀察數(shù)據(jù)均用珋x±s表示，低鈣血癥組和對(duì)照組相比;苦參堿和低鈣血癥組相比，各項(xiàng)指標(biāo)采用自身配對(duì)t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

表1 低鈣對(duì)豚鼠左心室流出道自律細(xì)胞的影響(珋x±s，n=8)

表2 苦參堿對(duì)低鈣致豚鼠左心室流出道自律細(xì)胞的影響(珋x±s，n=8)

3 討論

近年來發(fā)現(xiàn)，臨床上難以治療的由電解質(zhì)紊亂引起的室顫、早搏、心動(dòng)過速等心律失常常與心室流出道的結(jié)構(gòu)、形態(tài)和功能異常有關(guān)。目前，對(duì)心室流出道的生理學(xué)特性也越來越被人們所重視。我室前期對(duì)左心室流出道慢反應(yīng)自律細(xì)胞離子流的實(shí)驗(yàn)分析表明:在起搏電流中，If電流起一定作用;細(xì)胞0相主要去極離子流為Ca2+內(nèi)流，以及少量Na+內(nèi)流參與;復(fù)極過程主要由 K+離子外流引起;4相自動(dòng)除極化主要由K+外流的進(jìn)行性衰減形成以及ICa－L和 ICa－T的參與來完成，以 ICa－L離子通道參 與為主［4、5］。另外，左心室流出道組織動(dòng)作電位形態(tài)呈多樣性，即具有一定的電生理異質(zhì)性。心肌細(xì)胞電生理異質(zhì)性受多種病理生理因素如電解質(zhì)代謝平衡紊亂、酸中毒、缺血缺氧以及藥物等因素的影響，容易出現(xiàn)傳導(dǎo)異常和折返，尤其是折返性期前收縮和心動(dòng)過速等心律失常［6］。臨床上，電解質(zhì)紊亂如低鉀血癥、低鈣血癥等是威脅心臟正常功能并引起多種心律失常的重要因素之一。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，低鈣灌流液影響了豚鼠左心室流出道慢反應(yīng)自律細(xì)胞的正常功能，在實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)了陣發(fā)性心律失常表現(xiàn)。從細(xì)胞角度而言，心律失常是動(dòng)作電位的失常，而從分子角度來說心律失常則是離子流的失常和/或離子通道活性的失常。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，低鈣血癥是由于細(xì)胞外液鈣離子濃度降低，對(duì)Na+內(nèi)流的膜屏障作用減小，才導(dǎo)致心肌的興奮性、傳導(dǎo)性升高的［7］。在一些因素如藥物、自主神經(jīng)、體液因素發(fā)生變化時(shí)導(dǎo)致血中鈣離子濃度下降，會(huì)誘發(fā)心室流出道的機(jī)械牽張性發(fā)生改變而觸發(fā)局灶性電活動(dòng)，使其自律性發(fā)生改變，誘發(fā)心律失常。從離子通道活性的失常角度來看，低鈣增強(qiáng)了左心室流出道慢反應(yīng)自律細(xì)胞If和 ICa－L離子流，加快4期自動(dòng)去極化速率，使自動(dòng)興奮的頻率增加，自發(fā)放電頻率加快［8］。同時(shí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床觀察發(fā)現(xiàn)，苦參堿可通過作用于鈣離子通道使外鈣內(nèi)流，外鈣內(nèi)流可延長(zhǎng)有效不應(yīng)期，對(duì)消除折返激動(dòng)引起的心律失常可能會(huì)有一定的療效，主要表現(xiàn)為降低心肌細(xì)胞的興奮性，降低異位節(jié)律的發(fā)生率［9］。我室前期研究發(fā)現(xiàn)，在慢反應(yīng)自律細(xì)胞，細(xì)胞的興奮性取決于 L型Ca2+通道的功能狀態(tài)，有效不應(yīng)期與鈣、鉀離子電流有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，苦參堿明顯延緩了低鈣灌流液所導(dǎo)致的左心室流出道心肌細(xì)胞APD50、APD90的加快;并使APA、Vmax縮短，RPF逐漸變慢，自發(fā)放電頻率基本恢復(fù)正常，說明其拮抗了低鈣所導(dǎo)致的左心室流出道慢反應(yīng)自律細(xì)胞心律失常的發(fā)生。由此可以推測(cè)，苦參堿是通過作用于左心室流出道慢反應(yīng)自律細(xì)胞的ICa－L，影響了細(xì)胞復(fù)極化過程中的Ca2+內(nèi)流，使得4期自動(dòng)去極化速率減慢，自發(fā)放電頻率減慢來實(shí)現(xiàn)其作用的。本實(shí)驗(yàn)的目的是研究苦參堿的抗低鈣致心室流出道心律失常的作用機(jī)制，觀察苦參堿對(duì)低鈣誘發(fā)豚鼠心律失常的電生理影響。結(jié)果表明，用苦參堿灌流離體豚鼠左心室流出道慢反應(yīng)自律細(xì)胞可以降低由低鈣導(dǎo)致的自發(fā)放電頻率的升高，可使慢反應(yīng)自律細(xì)胞的興奮性降低。通過本實(shí)驗(yàn)我們也可以觀察到，苦參堿使左心室流出道慢反應(yīng)自律細(xì)胞的電生理發(fā)生明顯改變，提示苦參堿對(duì)治療低鈣導(dǎo)致的左心室流出道慢反應(yīng)自律細(xì)胞的異常電生理所致的心律失常有一定的療效，同時(shí)本實(shí)驗(yàn)也可以為苦參堿臨床心律失常用藥及其中藥學(xué)研究打下基礎(chǔ)。

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