不同基因型大豆GS1基因的克隆與分析

陳麗華，劉麗君，劉頁麗，裴宇峰，祖 偉*

（1.國家農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化監(jiān)測與研究中心，哈爾濱 150036；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030；3.黑龍江農(nóng)墾科研育種中心，哈爾濱 150090）

就植物的生長和發(fā)育而言，氮素的同化是個十分重要的生理過程。其中，無機氮必須同化為谷氨酰胺和谷氨酸等有機氮才能被植物體所吸收和利用。谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase，GS)是高等植物氮代謝中十分重要的酶，它和谷氨酸合成酶聯(lián)合作用，催化氨的同化，使其轉(zhuǎn)變成Gln和Glu，在高等植物體內(nèi)含氮有機物的生物合成中作為氮的供體[1]。高等植物的種子、葉、根、根瘤和果實等器官中分布著多種GS的同工酶。在植物葉片中存在兩種GS同工酶：一種定位于細胞質(zhì)部分，稱為胞液（胞質(zhì)）型GS-GS1；另一種定位于葉綠體部分，稱為葉綠體型GS-GS2［2］。在此前氮代謝規(guī)律的研究中大多將GS酶活性作為主要的測定指標(biāo)[3-4]，而缺乏不同基因型大豆在GS基因結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄水平的研究。本試驗通過對不同基因型大豆GS1基因的克隆和分析，為不同基因型大豆GS1基因的功能分析和轉(zhuǎn)錄水平的定量分析奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 不同基因型大豆

高油大豆品種：墾豐 9（KF9）、東農(nóng) 46（DN46）；高蛋白大豆品種：東農(nóng)42（DN42）、黑農(nóng)35（HN35）；秣食豆（MSD）；野生大豆（WS）。其中KF9、DN46、HN35、DN42由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供；秣食豆由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院提供；野生大豆由吉林農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

1.2 總RNA的提取

取不同基因型大豆幼苗幼嫩葉片，采用上海生工UNIQ柱式Trizol總RNA提取試劑盒提取總RNA。

1.3 DNA提取

取不同基因型大豆幼苗幼嫩葉片，采用CTAB法提取DNA[5]。

1.4 反轉(zhuǎn)錄

采用上海生工AMV第一鏈cDNA合成試劑盒。

1.5 目的基因的PCR擴增

根據(jù)GenBank上的大豆GS1基因序列，應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計基因特異引物。以基因組DNA或反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，使用LA Taq酶擴增基因序列。

GS1基因引物：

Sense：5′AAGGGTCTTTGCTTGATTTTG 3′

Antisense：5′AACGAGGGAAAGGAATAGAAG3′

1.6 PCR產(chǎn)物的電泳回收

參照上海華舜生物工程有限公司回收試劑盒說明書完成。

1.7 PCR產(chǎn)物的克隆

參照pMD18-T vector試劑盒說明進行連接。大腸桿菌感受態(tài)的制備、大腸桿菌的轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒DNA提取均采用常規(guī)方法[6]。

1.8 序列分析

應(yīng)用Clustal W軟件對所獲得的基因序列進行比較分析，分析不同基因型大豆GS1基因的差異，提取共有序列，并構(gòu)建分子進化樹。應(yīng)用DNAMan軟件的Translation功能將基因序列轉(zhuǎn)變成蛋白質(zhì)序列。應(yīng)用NetGene2軟件預(yù)測基因外顯子和內(nèi)含子。應(yīng)用NCBI在線spidey軟件和DNAMan軟件分析基因外顯子和內(nèi)含子。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基因型大豆GS1基因cDNA序列的克隆

通過RT-PCR擴增，在不同基因型大豆中均可擴增出約1300bp的目的大小GS1基因片段（見圖1）。回收1 300 bp的目的大小GS1基因片段，與pUCm-Tvector連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞。將篩選到的陽性克隆送交測序。

圖1 GS1基因的擴增Fig.1 Amplification of GS1 gene

2.2 不同基因型大豆GS1基因序列分析

經(jīng)測序獲得了6個不同基因型大豆的GS1基因序列，應(yīng)用Clustal W對比程序?qū)@6個基因序列進行比較分析，分析結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，來自不同基因型大豆的GS1基因序列相似性很高，因此能夠從中提取共有序列，并據(jù)此設(shè)計Real-time PCR引物，檢測不同基因型大豆GS1基因的表達規(guī)律。但是這些GS1基因序列間仍存在顯著的差異，有許多單堿基突變和插入缺失突變。其中非編碼區(qū)的差異顯著高于編碼區(qū)，并且全部的插入缺失突變都位于非編碼區(qū)，不會造成移碼突變。這說明非編碼區(qū)在進化過程中的選擇壓力小于編碼區(qū)，更易于積累基因突變。編碼區(qū)內(nèi)的堿基置換可能改變其所編碼的氨基酸序列或影響翻譯效率，進而造成酶活性和酶量的差異。由此導(dǎo)致不同基因型大豆氮代謝的差異，最終導(dǎo)致蛋白品質(zhì)上的差異。值得關(guān)注的是，在突變集中的3′端非編碼區(qū)，東農(nóng)42和半野生大豆GS1基因序列表現(xiàn)出極高的相似性，暗示著二者之間可能有著較近的親緣關(guān)系。

圖2 不同基因型大豆GS1基因序列比對結(jié)果Fig.2 Alignment of GS1 genes sequences from different genotype soybeans

根據(jù)不同基因型大豆GS1基因序列，應(yīng)用Clustal W軟件構(gòu)建了GS1基因分子進化樹（見圖3）。從分子進化樹中可以看出，東農(nóng)42、半野生大豆、東農(nóng)46 GS1基因序列進化距離較近。

2.3 不同基因型大豆GS1 蛋白質(zhì)序列分析

提取不同基因型大豆GS1基因的編碼區(qū)序列（CDS），應(yīng)用DNAMan軟件的Translation功能將其轉(zhuǎn)變成蛋白質(zhì)序列，應(yīng)用ClustalW對比程序?qū)@6個蛋白質(zhì)序列進行比較分析，分析結(jié)果表明不同基因型大豆GS1蛋白質(zhì)序列具有很高的相似性（比對結(jié)果圖略）。并且NCBI保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫（CDD）檢索結(jié)果表明，不同基因型大豆GS1蛋白質(zhì)序列都具有兩個保守的結(jié)構(gòu)域，催化結(jié)構(gòu)域（Gln-synt_N）和結(jié)合結(jié)構(gòu)域（Gln-synt_C），說明它們都具有催化功能（見圖4）。

圖3 不同基因型大豆GS1基因分子進化樹Fig.3 Evolutionary tree of GS1 genes from different genotype soybeans

圖4 GS1 蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.4 Analysis of conserved domains for GS1 protein

應(yīng)用Clustal W軟件構(gòu)建了這6個蛋白質(zhì)序列的分子進化樹（見圖5），從中可以看出東農(nóng)46和東農(nóng)42 GS1蛋白質(zhì)序列進化距離較近，墾豐9和黑農(nóng)35 GS1蛋白質(zhì)序列進化距離較近。盡管東農(nóng)42和半野生大豆GS1基因序列進化距離較近，但是在蛋白質(zhì)序列的分子進化樹中二者相距較遠，導(dǎo)致這一差異的原因是二者在GS1基因非編碼區(qū)的高度相似性。

圖5 不同基因型大豆GS1 蛋白質(zhì)分子進化樹Fig.5 Evolutionary tree of GS1 protein from different genotype soybeans

圖6 GS1基因基因組序列的PCR擴增Fig.6 PCR amplification of genomic sequence of GS1 genes

2.4 東農(nóng)42 GS1基因結(jié)構(gòu)分析

以東農(nóng)42基因組DNA為模板，用GS1基因特異引物進行PCR擴增，電泳結(jié)果如圖6所示，在49.8和52.8℃均可擴增出約4 kb的特異條帶。

經(jīng)測序獲得了東農(nóng)42 GS1基因的基因組序列，應(yīng)用NetGene2軟件預(yù)測基因外顯子和內(nèi)含子，預(yù)測結(jié)果顯示該基因具有12個外顯子和11個內(nèi)含子（見圖7）。應(yīng)用DNAMan軟件的Dot metrix功能對東農(nóng)42 GS1基因基因組序列和cDNA序列進行比對，可以很直觀地看出東農(nóng)42 GS1基因cDNA序列完全包含在其基因組序列中，二者形成12個匹配區(qū)段，說明東農(nóng)42 GS1基因基因組序列具有12個外顯子（圖略）。應(yīng)用NCBI在線spidey軟件對東農(nóng)42 GS1基因基因組序列和cDNA序列進行比對，同樣可以看出，東農(nóng)42 GS1基因cDNA序列具有12個外顯子，基因外顯子及其側(cè)翼序列的特征都符合GT、AG規(guī)則（圖略）。以上分析結(jié)果充分證明了東農(nóng)42 GS1基因具有12個外顯子和11個內(nèi)含子。

圖7 NetGene2軟件預(yù)測GS1基因外顯子和內(nèi)含子結(jié)果Fig.7 Graphics showing the prediction output of GS1 gene using NetGene2 software

3 討論

基因序列的差異影響蛋白質(zhì)序列，并最終導(dǎo)致酶分子結(jié)構(gòu)和功能的差異，因此研究不同基因型大豆關(guān)鍵酶基因序列的差異是闡明大豆品質(zhì)差異分子基礎(chǔ)的關(guān)鍵之一。目前關(guān)于氮代謝關(guān)鍵酶基因的研究主要集中在GS，大麥、玉米、水稻、豌豆、大豆、苜蓿等許多植物的GS cDNA已被克隆，但做不同基因型間序列比較以及基因組序列克隆和分析的很少。

本研究克隆了不同基因型大豆GS1基因的cDNA，比較了基因序列及其編碼的蛋白質(zhì)序列的差異，為闡明不同基因型大豆氮代謝差異的分子機理奠定了基礎(chǔ)。但是關(guān)于酶分子結(jié)構(gòu)與功能之間的相關(guān)性還有待于深入研究。為闡明GS1基因的結(jié)構(gòu)，本研究克隆了東農(nóng)42 GS1基因的基因組片段。生物信息學(xué)分析表明該基因包括12個外顯子和11個內(nèi)含子，這與Cock等在苜蓿中的研究結(jié)果一致，反映了不同物種間同源基因結(jié)構(gòu)的保守性[7]。

酶基因的表達調(diào)控是在不同水平上進行的，主要包括：①基因的結(jié)構(gòu)；②mRNA的轉(zhuǎn)錄和加工；③翻譯；④多肽的亞細胞定位、加工和修飾；⑤酶蛋白多聚體的組裝；⑥酶活性的調(diào)控；⑦酶的降解。其中轉(zhuǎn)錄水平和酶活性水平的調(diào)控是關(guān)鍵環(huán)節(jié)[8］。由于不同基因型、不同生育期以及不同部位酶基因mRNA豐度的差異有限，因此對mRNA的精確定量是轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控研究的關(guān)鍵。以前這方面的研究主要采用Northern雜交方法，不能實現(xiàn)精確定量。Real-time PCR技術(shù)的建立和發(fā)展使mRNA的精確定量成為可能。本研究比較了不同基因型大豆GS1基因的cDNA序列，發(fā)現(xiàn)了其共有序列，為設(shè)計通用Real-time PCR引物和探針，在轉(zhuǎn)錄水平研究不同基因型大豆GS1基因的表達規(guī)律奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

墾豐9、東農(nóng)46、東農(nóng)42、黑農(nóng)35、秣食豆、野生大豆的GS1基因序列相似性較高，不同基因型大豆GS1基因序列間的差異主要集中在非編碼區(qū)，東農(nóng)42、半野生大豆GS1基因序列進化距離較近。不同基因型大豆GS1蛋白質(zhì)序列具有很高的相似性，并且都具有兩個保守的結(jié)構(gòu)域，催化結(jié)構(gòu)域（Gln-synt_N）和結(jié)合結(jié)構(gòu)域（Gln-synt_C），東農(nóng)46和東農(nóng)42 GS1蛋白質(zhì)序列進化距離較近，墾豐9和黑農(nóng)35 GS1蛋白質(zhì)序列進化距離較近。東農(nóng)42 GS1基因具有12個外顯子和11個內(nèi)含子。

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