農(nóng)桿菌介導(dǎo)法構(gòu)建里氏木霉ura3基因突變體的研究

閆作梅，張 旭，李 杰

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

里氏木霉作為工業(yè)菌株，常用來生產(chǎn)多種重要的酶類，包括纖維素酶、半纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶等，具有巨大的商業(yè)價(jià)值[1-2]。目前，里氏木霉的基因組測序已經(jīng)完成，對于其基因的功能有待研究和開發(fā)[3]。同時(shí)，里氏木霉是理想的表達(dá)真核基因的系統(tǒng)，具有很好的合成和分泌蛋白的能力，在理想的培養(yǎng)條件下發(fā)酵分泌纖維素酶可達(dá)到40～100 g·L-1發(fā)酵液[4-5]，被稱為重組蛋白工廠。Harkki等報(bào)道，通過基因定位置換整合使編碼里氏木霉CBHI的基因失活，結(jié)果EGI的產(chǎn)量提高，不再產(chǎn)生CBHI；1993年，Karhunen等將編碼里氏木酶EGI的基因置于強(qiáng)啟動子CBHI的控制下，用此表達(dá)盒替換染色體的CBHI位點(diǎn)之后，EGI產(chǎn)量是通常強(qiáng)纖維素分解菌所產(chǎn)CBHI量的2倍或者與其一樣多；此外，還有一些關(guān)于里氏木酶的一個(gè)或幾個(gè)纖維素酶基因經(jīng)基因定位置換整合而失活的報(bào)道[6-7]。

在里氏木霉轉(zhuǎn)化研究中，常以營養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)基因作為篩選標(biāo)記，這種篩選標(biāo)記易于篩選獲得轉(zhuǎn)化子，被廣泛應(yīng)用到絲狀真菌的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中[8]。其中乳清酸核苷-5-磷酸脫羧酶（ura3）基因缺陷株及其相應(yīng)的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)己被證明是一種行之有效的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。由于5-氟乳清酸（5-FOA）對原養(yǎng)型菌株有毒性作用，而ura3缺陷菌株則對其產(chǎn)生抗性，所以提供了一種可以正反雙向篩選的篩選系統(tǒng)。

本研究嘗試?yán)棉r(nóng)桿菌介導(dǎo)法通過同源重組獲得里氏木霉ura3基因缺失突變體，從而為里氏木霉轉(zhuǎn)化系統(tǒng)研究提供材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和培養(yǎng)條件

大腸桿菌培養(yǎng)用LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)；里氏木霉菌種活化用土豆培養(yǎng)基，培養(yǎng)里氏木霉菌絲體用PDA培養(yǎng)基或MM培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)。

1.1.2 菌株和質(zhì)粒

菌株：大腸桿菌DH5α、農(nóng)桿菌GV3101、里氏木霉QM9414。

質(zhì)粒：pEMT-5由本實(shí)驗(yàn)室保存。1.1.3 分子試劑

膠回收試劑盒Gel Extract Kit（購自百泰克公司）。限制性核酸內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、rTaq酶、LA-Taq酶 、 dNTP、 PyrobestTMDNA Polymerase、pMD18-T vector等（購自大連寶（TaKaRa）生物工程有限公司）。

1.1.4 PCR引物設(shè)計(jì)

ura3引物序列如下：

pyrA引物序列如下：

ura3和pyrA基因農(nóng)桿菌PCR檢測引物序列：

1.2 方法

1.2.1 ura3和pyrA基因的克隆

以里氏木霉QM9414基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增ura3基因片段，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為1 469 bp。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性10 min，94℃變性1 min，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，72℃延伸10 min，4℃保存，30個(gè)循環(huán)。

以黑曲霉UV48基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增pyrA基因片段，大小為3 370 bp。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性10 min，94℃變性1 min，55℃退火30 s，72℃延伸4 min，72℃延伸10 min，4℃保存，30個(gè)循環(huán)。

1.2.2 ura3缺失基因載體和pyrA基因載體構(gòu)建

質(zhì)粒提取、酶切、轉(zhuǎn)化參見文獻(xiàn)[9]，連接參見文獻(xiàn)[10]，DNA片段回收參見膠回收試劑盒說明。

1.2.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌

取0.5～1 μL重組質(zhì)粒DNA，加入100 μL根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻；冰浴5 min，液氮冷凍8 min，迅速至37℃溫浴融化；加入800 μL YEB液體培養(yǎng)基，28℃，輕輕搖動4～5 h；

5 000 r·min-1離心5 min，倒掉大部分上清，將剩余約50 μL菌液用移液器轉(zhuǎn)至含有Km 100 mg·L-1、Gent 50 mg·L-1、Rif 50 mg·L-1的 YEB 固體培養(yǎng)基上涂勻。28℃暗培養(yǎng)48～96 h。

1.2.4 根癌農(nóng)桿菌和里氏木霉共培養(yǎng)

用5 mL滅菌蒸餾水從培養(yǎng)5～7 d的PDA平板上洗下里氏木霉菌的分生孢子，用MM液體培養(yǎng)基稀釋至相應(yīng)的孢子濃度。接種含雙元載體系統(tǒng)的pEMT-△ura3根瘤農(nóng)桿菌單菌落于3 mL液體YEB培養(yǎng)基（含 50 mg·L-1Rif、50 mg·L-1Gent、100 mg·L-1Kan）中，200 r·min-1，28 ℃培養(yǎng) 2～3 d，離心收集菌體，用一定體積的IM液體培養(yǎng)基重懸菌體。將菌液濃度調(diào)到660 nm處的吸收值為0.25，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，OD660達(dá)到0.6～0.8。取處理好的里氏木霉孢子懸液和根瘤農(nóng)桿菌菌液各100 μL，混勻，涂布MM 培養(yǎng)基（含 200 μmol·L-1乙酰丁香酮），24 ℃共培養(yǎng)48 h。

1.2.5 轉(zhuǎn)化子的篩選

將在24℃孵育48 h的培養(yǎng)物移至含有尿嘧啶核苷（1.87 mg·mL-1）、五氟乳氰酸（5 mg·mL-1）和阿莫西林（100 mg·mL-1）的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)8～10 d至抗性菌落出現(xiàn)。

1.2.6 轉(zhuǎn)化子的鑒定

提取轉(zhuǎn)化子的基因組DNA，PCR鑒定轉(zhuǎn)化子。如果ura3基因被敲除，擴(kuò)增出片段應(yīng)為445 bp；如果黑曲霉的pyrA插入到里氏木霉的基因組中，擴(kuò)增出650 bp的片段。

2 結(jié)果與分析

2.1 5-FOA篩選濃度的確定

將里氏木霉孢子接種于含不同濃度5-FOA的PDA固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)7 d后，里氏木霉生長情況見圖1。5-FOA濃度在5 mg·mL-1時(shí)即可有效抑制里氏木霉的生長，因此確定5-FOA篩選濃度為 5 mg·mL-1。

圖1 5-FOA對里氏木霉生長的抑制作用Fig.1 Inhibition effect of 5-FOA on the germination and growth of Trichoderma reesei strains

2.2 ura3和pyrA基因的克隆

ura3基因PCR擴(kuò)增得到一條1 469 bp的目的條帶（見圖2）；pyrA基因PCR擴(kuò)增得到一條3 300 bp的目的條帶（見圖3）。將上述擴(kuò)增條帶克隆至T載體，篩選陽性克隆送交測序。測序結(jié)果表明，已獲得完整的ura3基因和pyrA基因片段（序列略）。

2.3 ura3缺陷型載體的構(gòu)建

ura3缺陷型載體pEMT-△ura3的構(gòu)建過程見圖4。HindⅢ、XbaⅠ雙酶切質(zhì)粒pMD-ura3，回收約2 600和1 470 bp的片段。再將1 470 bp的小片段用SmaⅠ酶切，回收約650和700 bp片段。將上述3個(gè)片段連接，獲得質(zhì)粒pMD-△ura3。經(jīng)酶切和測序證明，該載體上的ura3基因缺失110 bp，結(jié)果正確。再用Eco RⅠ、NheⅠ雙酶切質(zhì)粒pEMT-5，回收約8 000 bp的載體片段，與經(jīng)同樣酶切質(zhì)粒pMD-△ura3回收的1 350 bp的目的片段連接，獲得載體pEMT-△ura3。通過凍融法將pEMT-△ura3轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，轉(zhuǎn)化菌落的PCR鑒定結(jié)果見圖5。

圖2 ura3基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Results of PCR amplification of ura3

圖3 pyrA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 Results of PCR amplification of pyrA

2.4 黑曲霉pyrA基因載體的構(gòu)建

黑曲霉pyrA基因載體pEMT-pyrA的構(gòu)建過程見圖6，將pEMT-ku70載體用XbaⅠ、Sna BⅠ雙酶切，回收11 524 bp的載體片段，然后用XbaⅠ，NcoⅠ雙酶切的黑曲霉pyrA基因片段與載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pEMT-pyrA。

圖4 pEMT-△ura3載體的構(gòu)建Fig.4 Construction of vector pEMT-△ura3

圖5 pEMT-△ura3轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌的鑒定結(jié)果Fig.5 Characterization of pEMT-△ura3 transfer in Agrobacterium

圖6 pEMT-pyrA載體的構(gòu)建Fig.6 Construction of vector pEMT-pyrA

通過凍融法將pEMT-△ura3轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，轉(zhuǎn)化菌落的PCR鑒定結(jié)果見圖7。

2.5 ura3基因缺失突變株的分子鑒定

通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將pEMT-△ura3轉(zhuǎn)化里氏木霉QM9414，將篩選平板上獲得的菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證（見圖 8）。

結(jié)果顯示隨機(jī)挑選的20個(gè)轉(zhuǎn)化子中只有1個(gè)可以擴(kuò)增得到ura3的缺失基因（445 bp，泳道13），即發(fā)生的是同源重組，將其命名為QM9414-△ura3突變株。還有5株（泳道3、7、9、10、12）同時(shí)擴(kuò)增出445和555 bp特異條帶，即發(fā)生的是非同源重組，其同源重組率為16.6%（1/6）。

圖7 pEMT-pyrA轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌的鑒定結(jié)果Fig.7 Characterization of pEMT-pyrA transfer in Agrobacterium

2.6 里氏木霉ura3基因缺失突變體的回復(fù)

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將pyrA基因轉(zhuǎn)化里氏木霉QM9414-△ura3突變株，在不含有尿嘧啶核苷酸的基本培養(yǎng)基平板上篩選回復(fù)突變株。然后應(yīng)用PCR篩選整合有pyrA基因的轉(zhuǎn)化子，在隨機(jī)挑取的30個(gè)轉(zhuǎn)化子中，有3個(gè)擴(kuò)增出目的基因（見圖9）。

圖8 △ura3基因缺失突變株的PCR檢測Fig.8 PCR detection of△ura3 gene disruptant

圖9 pyrA轉(zhuǎn)化子的PCR檢測Fig.9 PCR detection of pyrA gene

3 討論

目前，常用紫外誘變的方法對絲狀真菌的菌株進(jìn)行改造，但是不易控制誘變的位點(diǎn)。而同源重組利用DNA轉(zhuǎn)化技術(shù)，通過載體DNA序列與靶細(xì)胞內(nèi)染色體上同源DNA序列間的重組從而定向改變細(xì)胞遺傳特性，具有明顯的優(yōu)勢[8]。

由于絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)和選擇標(biāo)記被成功的應(yīng)用于許多的真菌轉(zhuǎn)化中，這就為人們在基因水平上研究真菌的遺傳背景和菌株的改造提供了有利的條件，其中以根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系備受關(guān)注[11-12]。根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的絲狀真菌轉(zhuǎn)化與傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)化方法相比具有以下優(yōu)點(diǎn)[13-16]：①轉(zhuǎn)化效率高；②可導(dǎo)入大片段的DNA；③導(dǎo)入基因拷貝數(shù)低，表達(dá)效果好，穩(wěn)定遺傳；④農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法使用的技術(shù)、儀器簡單；⑤同源重組效率高。Lima等利用傳統(tǒng)的PEG介導(dǎo)的方法對T.atroviride進(jìn)行轉(zhuǎn)化，同源重組的頻率很低，而利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法獲得了60%的同源重組的轉(zhuǎn)化子，使得其敲除基因的效率可達(dá)14%～75%，成功實(shí)現(xiàn)了對tmk1和tga3基因非編碼區(qū)的基因破壞[17]。

本試驗(yàn)全面考慮了高效基因修飾和置換技術(shù)的要點(diǎn)，有機(jī)整合了一些相關(guān)技術(shù)，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法提高里氏木霉的轉(zhuǎn)化效率，通過以ura3作為篩選標(biāo)記降低了轉(zhuǎn)化子的假陽性，提高導(dǎo)入DNA片段的同源重組效率。所建立的高效基因修飾和置換系統(tǒng)符合食品級表達(dá)系統(tǒng)的要求，由此所研制的工程菌和重組蛋白具有高度的安全性，可用于食品加工，應(yīng)用領(lǐng)域更為廣闊。

本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法將帶有△ura3基因的載體導(dǎo)入到里氏木霉宿主細(xì)胞內(nèi)，使載體上的△ura3基因與宿主細(xì)胞的染色體DNA發(fā)生同源重組，從而獲得以ura3作為篩選標(biāo)記的營養(yǎng)缺陷菌株，同時(shí)證實(shí)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法能高效的敲除里氏木霉基因，為研究里氏木霉的功能基因提供了高效的、快速的方法。

4 結(jié)論

本研究從里氏木霉QM9414中克隆了ura3基因，構(gòu)建了ura3基因敲除載體pEMT-△ura3。從黑曲霉中克隆了pyrA基因，構(gòu)建了pyrA基因載體pEMT-pyrA。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將ura3缺失基因轉(zhuǎn)化里氏木霉QM9414，篩選獲得QM9414-△ura3突變株，其同源重組率為16.6%。將pyrA基因轉(zhuǎn)化QM9414-△ura3突變株，篩選獲得回復(fù)突變株。

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