抗病毒轉(zhuǎn)基因番木瓜及其安全性問題

李世訪

（中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193）

番木瓜汁多味甜，營養(yǎng)豐富。不僅可以鮮食，而且可以制成飲料、果脯等，被稱為“百果之王”。但病毒病的發(fā)生成為威脅番木瓜生產(chǎn)的重要因素。

1948年Jensen在夏威夷的瓦胡島上發(fā)現(xiàn)番木瓜上有一種病毒引起的病害，他將該病毒命名為“番木瓜環(huán)斑病毒（Papaya ring spot virus，PRSV）”。PRSV屬于馬鈴薯Y病毒，它是通過幾種非持久性傳毒的蚜蟲進行傳播的［1］。20世紀50年代，瓦胡島是夏威夷番木瓜的主要種植地區(qū)，但是受PRSV的影響迫使這個產(chǎn)業(yè)遷移到了夏威夷的普納地區(qū)，該地區(qū)不存在這種病毒，而且有充足的土地、雨水、陽光和以火山巖為基底的良好排水系統(tǒng)。并且，新的‘卡波霍’番木瓜品種也適合在普納地區(qū)種植。到了70年代，普納生產(chǎn)的番木瓜占夏威夷番木瓜的95%，但由于普納距離疫區(qū)只有30 k m，PRSV的潛在威脅依然存在。種植抗病品種是防治該病毒病害的有效措施，但番木瓜栽培品種中缺乏抗性資源，野生番木瓜中的抗性資源又很難通過常規(guī)的雜交方法轉(zhuǎn)移到番木瓜栽培品種中，因此對該病尚無有效的防治方法。轉(zhuǎn)基因番木瓜在這一背景下應運而生［2－6］。

1 轉(zhuǎn)基因番木瓜的研發(fā)

1．1 PDR－源于病原物基因介導的抗性

源于病原物基因介導的抗性（pathogen derived resistance，PDR）是指把病原物基因或者其中的一部分導入寄主植物中，使植物獲得抵抗該病原物能力的一種現(xiàn)象［7］。Beachy等于1996年首次報道了PDR在植物抗病毒中的應用，發(fā)現(xiàn)將煙草花葉病毒（T MV）外殼蛋白在煙草和馬鈴薯中表達，可使這些植株獲得對T MV的抗性［8］。通過大量的研究，已確切證明了PDR在植物病毒控制方面具有實際成效。事實上，通過應用PDR，大量的作物獲得了對植物病毒的抗性。最初認為，為獲得抗性必須有病毒外殼蛋白（CP）表達，后來大量的研究顯示具有病毒CP的轉(zhuǎn)基因植物實際上只能對具有相同或相似CP的病毒表現(xiàn)特異抗性［9－12］。然而，10年后，研究顯示大多數(shù)植物病毒PDR是由RNA介導，通過轉(zhuǎn)錄后基因沉默（PTGS）機制起作用的。PTGS現(xiàn)在被認為是一種RNA沉默介導的抗病毒途徑。從根本上說，利用病毒轉(zhuǎn)基因誘導RNA沉默可導致入侵的同源病毒的基因組以及高序列同源性病毒基因的退化，從而使植株表現(xiàn)抗性。病毒基因的全長結(jié)構(gòu)或片段結(jié)構(gòu)，如CP、依賴RNA的RNA聚合酶（Rd Rp）、蛋白酶、運動蛋白、衛(wèi)星 RNA、缺陷干擾RNA和非編碼區(qū)等，都被用于介導抗性。而且有研究顯示，某些病毒基因可以抑制RNA沉默，從而降低了植物中通過PDR介導的轉(zhuǎn)基因抗性效果［11，13－14］。盡管如此，雖然 PDR 機制的研究取得了巨大的進步，但仍然是靠經(jīng)驗來確定抗性表型。從根本上說，經(jīng)過改造和轉(zhuǎn)化的植物要通過接種來定期篩選抗靶標病毒的抗性。選擇優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因品系，能更符合商業(yè)化的特點，包括他們對環(huán)境和食品安全的潛在風險的徹底評估。

1．2 抗病毒轉(zhuǎn)基因植物的優(yōu)點

PDR介導的抗病毒轉(zhuǎn)基因植物是控制植物病毒的有效手段，抗病毒轉(zhuǎn)基因技術(shù)還具有以下幾個特點：首先病毒抗性可以不改變其表型屬性并被植物體獲得，這是靠傳統(tǒng)育種幾乎不能實現(xiàn)的。其次同樣的抗性基因可以轉(zhuǎn)入不同種屬的植株中，這些植株會受轉(zhuǎn)入病毒影響并易于進行轉(zhuǎn)化和改造。再次，抗性還可以被無性繁殖的植株獲得，這些植株由于基因的不親和性，通過傳統(tǒng)育種是無法進行改造的或者連接不上目的性狀。

1．3 美國抗病毒轉(zhuǎn)基因番木瓜的研發(fā)

美國從1985年開始致力于開發(fā)抗PRSV的轉(zhuǎn)基因番木瓜研究，1989年對PRSV毒株HA5－1的CP基因進行克隆和測序，開始番木瓜胚胎的基因槍轉(zhuǎn)化，在1991年獲得了抗PRSV毒株HA的轉(zhuǎn)基因番木瓜品系‘55－1’［2－6］。1992年 4 月，轉(zhuǎn)基因品系‘55－1’R0代植株的小型田間試驗在瓦胡島進行。到了1992年12月，試驗數(shù)據(jù)充分表明品系‘55－1’在田間條件下對PRSV的抗性表現(xiàn)良好。這樣的田間試驗是非常重要的，因為目前商業(yè)品種‘日出’和‘彩虹’也是通過這種田間試驗開發(fā)出來的［15］。

1992年5月，在普納的商業(yè)化番木瓜種植園中發(fā)現(xiàn)了PRSV。盡管人們通過觀察和砍伐來努力抑制PRSV的傳播，但是到了1994年普納超過一半的番木瓜都被PRSV侵染，因此夏威夷農(nóng)業(yè)研究所放棄了對該病害的撲滅程序。到了1998年，普納的許多番木瓜都被PRSV侵染，番木瓜產(chǎn)量也減少到了1992年時的一半。

1995年5月，與非轉(zhuǎn)基因木瓜一樣‘日出’和‘彩虹’在普納開始了田間試驗，以確定控制PRSV病害的抗性工程的成效，并評估轉(zhuǎn)基因栽培品種的園藝學品質(zhì)［16］。這個田間試驗對研究者、政府官員和種植者來說是非常成功和具有說服力的，這兩個轉(zhuǎn)基因品種特別是‘彩虹’在夏威夷已進行了商業(yè)化。事實上，轉(zhuǎn)基因品系‘55－1’的父本和母本在1996年通過了美國農(nóng)業(yè)部動植物健康檢驗局（APHIS）的認證，1997年通過了環(huán)境保護署的許可，與食品和藥物行政部門的協(xié)商也在1997年完成。1998年4月，番木瓜行政委員會（PAC）獲得了商業(yè)化轉(zhuǎn)基因番木瓜的通行證［2］。PAC承包生產(chǎn)‘日出’和‘彩虹’的種子，隨后根據(jù)需要和生產(chǎn)區(qū)域PRSV的嚴重程度，開始免費發(fā)放種子給種植者［17］。

1．4 我國轉(zhuǎn)基因番木瓜的研究

自1996年首例轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物商業(yè)化應用以來，全球轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究與產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展。雖然夏威夷轉(zhuǎn)基因番木瓜已開發(fā)了兩個優(yōu)良品系，但對我國華南地區(qū)4個番木瓜環(huán)斑病毒（PRSV）株系［18］、我國臺灣以及泰國等亞洲國家的番木瓜環(huán)斑病毒（PRSV）株系不具有抗性。因此，不同國家和地區(qū)必須要選用當?shù)貎?yōu)勢病毒株系的基因重新進行轉(zhuǎn)基因研究，才能獲得具有對當?shù)夭《局晗悼剐暂^好的轉(zhuǎn)基因品系。華南農(nóng)業(yè)大學在國內(nèi)率先進行抗PRSV轉(zhuǎn)基因番木瓜的基因工程研究。他們利用基因工程的技術(shù)手段，將我國華南地區(qū)PRSV的優(yōu)勢株系YS［19］的復制酶基因轉(zhuǎn)入番木瓜植株，獲得了高抗的轉(zhuǎn)基因品系‘華農(nóng)1號’。于2006年獲得在廣東省應用的安全證書，在廣東大規(guī)模種植后，產(chǎn)生了極大的經(jīng)濟、社會和環(huán)境效益。從根本上解決了番木瓜生產(chǎn)受PRSV威脅的問題，從而恢復了番木瓜“嶺南佳果”美譽，并供應國內(nèi)外市場，也滿足了食品工業(yè)、醫(yī)藥和保健等開發(fā)的需要。

2 轉(zhuǎn)基因番木瓜國際競爭動態(tài)與趨勢

美國是世界上首先批準種植轉(zhuǎn)基因番木瓜的國家［3，17］。加拿大和日本是美國夏威夷番木瓜產(chǎn)業(yè)的兩大消費市場，分別占20%和11%。2003年3月，加拿大批準了美國轉(zhuǎn)基因番木瓜品系‘日出’和 ‘彩虹’的進口。日本十多年來對轉(zhuǎn)基因番木瓜一直采取抵制措施，隨著轉(zhuǎn)基因番木瓜安全性的進一步確認，2010年5月，日本已經(jīng)允許轉(zhuǎn)基因番木瓜進口本國市場。因此，從世界范圍來看，轉(zhuǎn)基因番木瓜處在被人們逐漸接受的階段，而且國際市場也呈現(xiàn)不斷擴大的趨勢。

3 為什么要種植轉(zhuǎn)基因番木瓜

轉(zhuǎn)基因番木瓜高抗番木瓜環(huán)斑病毒（PRSV），不但提高番木瓜產(chǎn)量和品質(zhì)，還可大大降低生產(chǎn)成本。種植轉(zhuǎn)基因番木瓜至少有以下3點好處。

3．1 轉(zhuǎn)基因番木瓜促進非轉(zhuǎn)基因番木瓜的生產(chǎn)

夏威夷仍需要生產(chǎn)非轉(zhuǎn)基因番木瓜以滿足可觀的出口日本市場的需要。由于2010年以前日本對抗PRSV轉(zhuǎn)基因番木瓜還未開放。因此，夏威夷為了保持其在日本的市場份額，還需要繼續(xù)生產(chǎn)非轉(zhuǎn)基因番木瓜，這是一個間接的轉(zhuǎn)基因番木瓜促進非轉(zhuǎn)基因番木瓜生產(chǎn)的例子。

此外，普納轉(zhuǎn)基因番木瓜實際上使得非轉(zhuǎn)基因木瓜的生產(chǎn)成為了可能。這是往往容易被忽略的抗PRSV轉(zhuǎn)基因番木瓜的重要好處。在普納種植的非轉(zhuǎn)基因品種‘卡波霍’一直是在日本占主導地位的夏威夷番木瓜。在普納的許多地區(qū)，番木瓜果園在大量非轉(zhuǎn)基因番木瓜植株周圍種植轉(zhuǎn)基因番木瓜，因為轉(zhuǎn)基因番木瓜可以作為屏障，清除帶PRSV的蚜蟲，以防它們侵襲非轉(zhuǎn)基因木瓜。這種方法促進了非轉(zhuǎn)基因番木瓜的經(jīng)濟增長。

3．2 轉(zhuǎn)基因番木瓜促進了番木瓜生產(chǎn)用地的減少

抗PRSV轉(zhuǎn)基因番木瓜可以種植在有病毒侵染的土地上，從而隔離病毒來源以促進非轉(zhuǎn)基因番木瓜的種植。所以，種植者們清理出來的新區(qū)域除了再次種植番木瓜以外還可用于種植其他作物。常被忽略的抗PRSV轉(zhuǎn)基因番木瓜的環(huán)境效益是非常重要的，因為普納的土地和夏威夷其他州的土地非常有限，而且其生物多樣性也是非常難得的。

3．3 轉(zhuǎn)基因番木瓜有助于增加番木瓜品種多樣性

轉(zhuǎn)基因番木瓜可以增加番木瓜品種的多樣性，擴大瓦胡島的番木瓜市場。1998年，95%的夏威夷番木瓜品種為‘卡波霍’，‘朝霞’和‘深谷’品種不到5%。今天，夏威夷的種植者們有機會在由于PRSV影響商業(yè)生產(chǎn)廢棄的瓦胡島種植抗PRSV的‘日出’、‘彩虹’和‘拉耶金’等品種。1996年瓦胡島種植番木瓜2．2 hm2，現(xiàn)在種植抗病毒番木瓜57 hm2。如果沒有抗PRSV轉(zhuǎn)基因番木瓜的釋放和采用［3］，這種情況是不可能發(fā)生的。

4 轉(zhuǎn)基因番木瓜的安全性

4．1 食用安全性與致敏性、耐藥性

影響人類健康的致敏反應是指轉(zhuǎn)基因植物中病毒序列編碼的蛋白對人體的潛在過敏性［20］。大量觀察表明，轉(zhuǎn)基因番木瓜的病毒蛋白對過敏安全性不構(gòu)成威脅。實際上，在我們?nèi)粘Ｉ钪?，?jīng)常消費著感染了病毒的水果和蔬菜，只不過人們沒有意識到。但并沒有因此而出現(xiàn)由植物病毒成分引起的不良反應。自植物病毒發(fā)現(xiàn)以來，至今還沒有發(fā)現(xiàn)植物病毒可以侵染人類的案例。我國對轉(zhuǎn)基因番木瓜的食用安全性、過敏原性也進行了長期跟蹤研究，沒有發(fā)現(xiàn)任何安全問題。

從轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因番木瓜青果種子、青果果肉、熟果種子、熟果果肉中提取番木瓜中的一種內(nèi)源毒物—芐基異硫氰酯（benzyl：sothiocyanate，BITC），將提取后濃縮的樣品，進行氣相色譜分析，然后將結(jié)果進行生物統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因番木瓜對BITC的含量并無影響。該研究表明：轉(zhuǎn)基因番木瓜不大可能有致敏性，并且內(nèi)源毒物BITC的含量與非轉(zhuǎn)基因番木瓜無顯著差異［21］。

轉(zhuǎn)基因番木瓜含有抗生素抗性基因，人們擔心食用這些木瓜可能會造成人類對部分抗生素產(chǎn)生耐藥性，如其中的卡那霉素抗性基因。然而卡那霉素抗性基因來自于細菌，在培育轉(zhuǎn)基因植株中廣泛應用。在轉(zhuǎn)基因木瓜培育過程中也用來篩選轉(zhuǎn)基因植株。經(jīng)過長期的研究和觀察，大量數(shù)據(jù)證明卡那霉素抗性基因在轉(zhuǎn)基因植物中是安全的［22］，針對一些人的質(zhì)疑，2011年4月13日，歐盟食品安全局轉(zhuǎn)基因?qū)＜倚〗M公布一份科學報告，再次確認將卡那霉素抗性基因NptⅡ用于轉(zhuǎn)基因作物的選擇標記基因?qū)θ梭w、動物健康以及環(huán)境沒有風險。

卡那霉素抗性基因是天然普遍存在的：在自然界的大量植物中，本來就存在一些植物可以忍耐這種抗生素。在土壤、水和其他環(huán)境，甚至在人和動物的腸胃通道里，具有卡那霉素抗性的微生物大量存在。自然界中卡那霉素抗性微生物的廣泛背景意味著人類和動物時時刻刻都暴露在卡那霉素抗性生物中，競爭并共存著。

此時人們可能還會質(zhì)疑，外源基因是否有進行水平轉(zhuǎn)移的可能性呢？外源基因水平轉(zhuǎn)移的可能性是非常小的，因為轉(zhuǎn)基因食品中的外源基因特別是抗生素抗性基因被攝入人體后，水平轉(zhuǎn)移至腸道生物或上皮細胞，從而對人體產(chǎn)生不利影響的可能性非常小，目前沒有基因從植物轉(zhuǎn)移到腸道微生物的證據(jù)，也沒有在人類消化系統(tǒng)中細菌轉(zhuǎn)化的報道。故轉(zhuǎn)基因番木瓜中的卡那霉素抗性基因?qū)θ祟惒淮嬖诳股蒯t(yī)療安全性的問題。

4．2 農(nóng)藥殘留

轉(zhuǎn)基因木瓜的抗性，特別是抗蟲抗病能力的存在可以大大減少種植過程中農(nóng)藥的使用，以降低農(nóng)藥殘留對于人類的危害。我國耕地面積僅為美國的2／3，但農(nóng)藥年用量高達120多萬t，化肥年施用量約4 000萬t，分別是美國的2倍和4倍，環(huán)境污染嚴重［23］。研究表明，過去10年全球抗蟲轉(zhuǎn)基因作物的應用，減少農(nóng)藥使用量（有效成分）超過22萬t，相當于減少15%農(nóng)藥對作物及環(huán)境的影響。例如我國抗蟲轉(zhuǎn)基因棉花的應用，累計減少殺蟲劑60萬t。因此，轉(zhuǎn)基因番木瓜比非轉(zhuǎn)基因番木瓜將顯著減少農(nóng)藥、化肥的使用，緩解資源短缺、環(huán)境惡化等嚴重問題，食用更安全［24］。

4．3 生態(tài)效益與社會效益

農(nóng)業(yè)生物技術(shù)是一場新的綠色產(chǎn)業(yè)革命，它將給農(nóng)民、消費者和社會帶來更多的利益方便和安全保障。轉(zhuǎn)基因技術(shù)是現(xiàn)代生物技術(shù)的核心，運用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、多抗、高效的新品種，能夠降低農(nóng)藥、肥料投入，對緩解資源約束、保護生態(tài)環(huán)境、改善產(chǎn)品品質(zhì)、拓展農(nóng)業(yè)功能等具有重要作用。轉(zhuǎn)基因技術(shù)帶來的生態(tài)效益、經(jīng)濟效益十分顯著［25］。1996－2007年，全球轉(zhuǎn)基因作物累計收益高達440億美元，累計減少殺蟲劑使用35．9萬t。2008年，全球共有55個國家批準了24種轉(zhuǎn)基因作物進入市場銷售，市場價值達到75億美元［26］。

4．4 真實的風險與預測的風險

有關(guān)抗病毒轉(zhuǎn)基因作物安全性問題的許多研究都已經(jīng)進行，特別是異源包裝和重組的問題。但是，只有少數(shù)風險評估具有現(xiàn)實意義，更多的則是有關(guān)病毒和寄主的相互作用而不是安全性。區(qū)分與抗病毒轉(zhuǎn)基因植物相關(guān)的預測風險和真實風險是非常重要的。因為人們特別是缺少相關(guān)專業(yè)知識的民眾，很容易混淆轉(zhuǎn)基因作物的預測風險和真實風險。迄今為止，還沒有可信的證據(jù)表明，表達病毒基因的轉(zhuǎn)基因植物可以增加異源包殼或重組頻率。同樣，幾乎沒有證據(jù)推斷，表達病毒基因的轉(zhuǎn)基因植物可改變現(xiàn)存病毒種群的特點或產(chǎn)生新的病毒。我們更注重結(jié)果而不是特殊潛在風險的發(fā)生概率。故目前尚沒有明確證據(jù)證明轉(zhuǎn)基因食品是不安全的，所有的風險和危害都是預測的，現(xiàn)實當中尚未存在。

綜上所述，其實人們不必對轉(zhuǎn)基因番木瓜如此驚慌，轉(zhuǎn)基因番木瓜與非轉(zhuǎn)基因番木瓜相比，在微生物毒素、農(nóng)藥殘留等方面更安全，至今尚未發(fā)現(xiàn)一例因食用轉(zhuǎn)基因番木瓜導致的中毒或醫(yī)療事故。

5 轉(zhuǎn)基因木瓜的標識問題

我國政府非常重視轉(zhuǎn)基因生物及其安全性研究工作，評價過程嚴謹，程序規(guī)范。對轉(zhuǎn)基因植物的生產(chǎn)和種植采取了一系列措施。2002年1月，農(nóng)業(yè)部發(fā)布了《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標識管理辦法》，同時發(fā)布了《第一批實施標識管理的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物目錄》，番木瓜還沒有被列入此目錄中，因此沒有硬性規(guī)定一定要標識出來。

目前，番木瓜栽培在我國南方屬于個體行為，通過行政手段要求每家每戶對轉(zhuǎn)基因番木瓜進行標識，不僅成本高，操作起來也很困難。轉(zhuǎn)基因番木瓜沒有必要遮遮掩掩，因為目前尚沒有證據(jù)證明轉(zhuǎn)基因番木瓜是不安全的。我國農(nóng)業(yè)部成立的農(nóng)業(yè)生物基因工程安全管理辦公室和農(nóng)業(yè)生物基因工程安全委員會，對轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品的商品化生產(chǎn)進行了嚴格的安全評價。轉(zhuǎn)基因木瓜就是經(jīng)過多年嚴格安全評價，確認安全后獲得商業(yè)化許可的。但為了保護消費者的知情權(quán)，農(nóng)業(yè)部正在研究轉(zhuǎn)基因番木瓜標識的操作程序，以后消費者就可以根據(jù)自己的判斷購買自己喜歡吃的轉(zhuǎn)基因或非轉(zhuǎn)基因番木瓜。

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