甘丙肽重構(gòu)基因GAL（intronII）的克隆及其過表達(dá)轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建

雷小春，劉田福，司蘇晉，薛亮亮，張引紅

（山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，太原 030001）

甘丙肽（galanin，GAL）是Tatemoto等于1983年從豬小腸提取出的由29個(gè)氨基酸（人類的GAL由30個(gè)氨基酸組成）組成的羧基末端酰胺化的肽類物質(zhì)，GAL廣泛分布在外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在下丘腦、海馬、杏仁核、中縫背核、前腦基底皮層、室下帶、嗅球以及脊髓背根神經(jīng)節(jié)等區(qū)域都可檢測(cè)到GAL及其受體的表達(dá)［1］。在正常生理過程GAL表達(dá)水平比較低而穩(wěn)定，但是在一些病理過程中GAL表達(dá)會(huì)有異常的變化［2］。近年研究還發(fā)現(xiàn)GAL與阿爾茨海默病、癲癇，高泌乳血癥、抑郁、神經(jīng)痛等的發(fā)病機(jī)制相關(guān)，同時(shí)也與攝食、學(xué)習(xí)和記憶等功能相關(guān)［3-6］。當(dāng)前對(duì)于GAL轉(zhuǎn)基因模型的研究熱點(diǎn)主要集中于GAL缺失表達(dá)或者過表達(dá)模型中某些疾病相關(guān)的生理、病理特征，定位GAL在這些生理、病理過程中的作用，而在這些研究數(shù)據(jù)的取得大多數(shù)是建立在GAL轉(zhuǎn)基因模型的基礎(chǔ)上的［7-9］。

為了研究人PDGF-β啟動(dòng)子調(diào)控下GAL的表達(dá)，構(gòu)建GAL過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，對(duì)GAL各項(xiàng)功能進(jìn)行研究，我們構(gòu)建了能夠在小鼠體神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛過量表達(dá)的GAL轉(zhuǎn)基因載體，為下一步進(jìn)行顯微注射做好準(zhǔn)備。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：C57BL/6小鼠由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［SCXK（晉）2009-0001］。

1.1.2 菌株和質(zhì)粒：含人血小板源性生長(zhǎng)因子啟動(dòng)子片段的psisCAT6α質(zhì)粒由中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心秦川教授惠贈(zèng)。大腸桿菌DH5a，質(zhì)粒pMD-19simple，pUC18均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.3 試劑：RNAiso Reagent，DNA Fragment Purification Kit，DNA A-TailingKit，DNA WideRangeDNA Marker（100-6000）購自寶生物工程（大連）有限公司；Phusion超保真聚合酶，SalI，PstI，XbaI，HindIII限制性內(nèi)切酶購自NEB公司；AMV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑購自Promega公司；QIAquick Gel Extraction kit購自Qiagen公司，Plasmid Mini Kit購自O(shè)mega公司；X-Gal、IPTG、Amp購自Amresco公司。

1.1.4 主要引物：RT-PCR、常規(guī)PCR引物均參照GenBank中GAL基因和cDNA的標(biāo)準(zhǔn)序列，使用PrimerPremier5.0，Oligo6.72軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)。重疊延伸PCR引物根據(jù)理論上得出的重疊產(chǎn)物重新設(shè)計(jì)：正向引物F5′AAGGCGCCGGCGATATCCGGCCTGGT CGACTGCCACGGACACGTAGAG 3′，下劃線序列為SalI限制性酶切位點(diǎn)；反向引物R5′AACGTTTA CGAACCTGCAGCGATACGCTGCAGCATAGACG3′，下劃線序列為PstI限制性酶切位點(diǎn)。由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 C57BL/6小鼠總RNA、基因組DNA的提?。禾幩佬∈螅⌒迈r腦組織，用RNAiso試劑和DNA提取試劑盒分別提取C57BL/6小鼠總RNA和基因組DNA，用紫外可見分光光度計(jì)檢測(cè)定RNA的濃度為1.47μg/μL，純度為1.98；DNA的濃度為0.33μg/μL，純度為1.78。

1.2.2 擴(kuò)增GAL全長(zhǎng)cDNA：RT-PCR擴(kuò)增GAL cDNA的編碼部分的片段，常規(guī)PCR擴(kuò)增GAL cDNA5′和3′部分非編碼序列片段及GAL第二內(nèi)含子，以GAL cDNA的編碼部分和5′、3′部分非編碼序列片段通過重疊延伸PCR的方法獲得GAL的cDNA全長(zhǎng)片段（包括編碼部分、5′端和3′端部分非編碼片段），分別用1.2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定并測(cè)序。

1.2.3 在GAL全長(zhǎng)cDNA中插入第二內(nèi)含子構(gòu)建重構(gòu)分子GAL（intronII）：常規(guī)PCR：GAL第二內(nèi)含子需要插入的位點(diǎn)在GAL全長(zhǎng)cDNA第三外顯子的第15個(gè)堿基處，以插入位點(diǎn)兩側(cè)的25個(gè)堿基加上第二內(nèi)含子兩端的25個(gè)堿基共50個(gè)堿基分別作為引物，與擴(kuò)增GAL全長(zhǎng)cDNA的引物分別配對(duì)，組成兩組引物將插入位點(diǎn)兩端的片段擴(kuò)增出來，即將GAL全長(zhǎng)cDNA切成了兩部分。1.2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，測(cè)序。

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，促使了其對(duì)于蝦、蟹等沉性飼料持續(xù)增長(zhǎng)的需求。面對(duì)競(jìng)爭(zhēng)日趨激烈的市場(chǎng)，水產(chǎn)飼料生產(chǎn)以及水產(chǎn)養(yǎng)殖企業(yè)對(duì)于沉性水產(chǎn)飼料的品質(zhì)要求愈發(fā)提高：飼料外觀、水中穩(wěn)定性、吸水透心性、飼喂效果以及飼料轉(zhuǎn)化率等等，都成為評(píng)價(jià)沉性水產(chǎn)飼料品質(zhì)優(yōu)劣的標(biāo)準(zhǔn)。面對(duì)以上問題，牧羊有限公司在長(zhǎng)期的實(shí)驗(yàn)研發(fā)以及實(shí)踐生產(chǎn)過程中，對(duì)影響沉性水產(chǎn)飼料品質(zhì)的部分因素進(jìn)行了一些總結(jié)和分析。

重疊PCR：將上述步驟獲得的GAL全長(zhǎng)cDNA的兩部分以及GAL第二內(nèi)含子PCR產(chǎn)物等摩爾比混合作為重疊PCR的模板，延伸5個(gè)循環(huán)，加入引物。擴(kuò)增條件：98℃預(yù)變性1min，98℃、5s，68℃、15s，72℃、50s，共25個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min，擴(kuò)增出重構(gòu)基因GAL（intronII）。1.2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，測(cè)序。

1.2.4 重組質(zhì)粒pMD19-T Simple/GAL（intronII）的構(gòu)建：膠回收GAL（intronII）片段PCR產(chǎn)物，進(jìn)行加A反應(yīng)，與pMD19-T Simple載體片段以摩爾比為3：1的比例混合，加入等體積solution I，16℃進(jìn)行連接反應(yīng)16h。以pMD19-T Simple載體自我連接作為陰性對(duì)照。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，同時(shí)轉(zhuǎn)化陽性對(duì)照pUC18質(zhì)粒和陰性對(duì)照pMD19-T Simple載體自我連接反應(yīng)液。取150μL轉(zhuǎn)化菌液涂于含氨芐青霉素（100mg/L）、IPTG（20mg/mL）和X-Gal（20mg/mL）的LB平板上，37℃孵育16h，隨機(jī)挑10個(gè)白色單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)提取質(zhì)粒，經(jīng)SalI、PstI分步酶切篩選陽性克隆。將含插入GAL（intronII）片段的質(zhì)粒測(cè)序。

1.2.5 重組載體pUC18/PDGF-β-promoter的構(gòu)建：將psisCAT6α轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中DH5a感受態(tài)細(xì)胞，37℃平板培養(yǎng)16h。隨機(jī)挑取菌落接種在加有氨芐青霉素（100mg/mL）的5mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃，225r/min振蕩培養(yǎng)過夜。收集菌體提取質(zhì)粒，電泳進(jìn)行初步鑒定。鑒定后取適量psisCAT6a質(zhì)粒溶液和pUC18質(zhì)粒溶液用限制性核酸內(nèi)切酶SalI，XbaI于37℃酶切3h。膠回收純化PDGF-β啟動(dòng)子片段和線性pUC18，用Quantity One分析軟件進(jìn)行定量。將PDGF-β啟動(dòng)子片段和線性pUC18按3：1的比例16℃進(jìn)行連接反應(yīng)16h。以線性pUC18的自我連接作為陰性對(duì)照。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，同時(shí)轉(zhuǎn)化陽性對(duì)照pUC18質(zhì)粒和陰性對(duì)照線性pUC18自我連接反應(yīng)液。取150μL轉(zhuǎn)化菌涂于含氨芐青霉素（100mg/L）、IPTG（20mg/mL）和X-Gal（20mg/mL）的LB平板上，37℃孵育16h。隨機(jī)挑10個(gè)白色單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)提取質(zhì)粒，經(jīng)XbaI和SalI雙酶切篩選陽性克隆。將含PDGF啟動(dòng)子插入片段的質(zhì)粒測(cè)序。

1.2.6 重組載體pUC18/PDGF-β-promoter/GAL（intronII）的構(gòu)建：取適量的pUC18/PDGF-βpromoter質(zhì)粒和pMD19-TSimple/GAL（intronII）質(zhì)粒用限制性核酸內(nèi)切酶SalI，PstI于37℃酶切3h，膠回收純化GAL（intronII）片段和線型pUC18/PDGF-β-promoter，用Quantity One分析軟件進(jìn)行定量。將GAL（intronII）片段與線型pUC18/PDGF-β-promoter按3：1的比例16℃進(jìn)行連接反應(yīng)16h。以線型pUC18/PDGF-β-promoter的自我連接作為陰性對(duì)照。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，同時(shí)轉(zhuǎn)化陽性對(duì)照pUC18質(zhì)粒和陰性對(duì)照線性pUC18/PDGF-β-promoter自我連接反應(yīng)液。取150μL轉(zhuǎn)化菌涂于含氨芐青霉素（100mg/L）、IPTG（20mg/mL）和X-Gal（20mg/mL）的LB平板上，37℃孵育16h。隨機(jī)挑取白色菌落擴(kuò)大培養(yǎng)提取質(zhì)粒，經(jīng)XbaI和HindⅢ雙酶切篩選陽性克隆。將含轉(zhuǎn)基因片段PDGF-β-promoter/GAL（intronII）的質(zhì)粒測(cè)序。

所有測(cè)序中美泰和生物技術(shù)（北京）有限公司完成，使用Clustalw軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 GAL全長(zhǎng)cDNA構(gòu)建結(jié)果鑒定

由RT-PCR、常規(guī)PCR、重疊延伸PCR擴(kuò)增得到了GAL的全長(zhǎng)cDNA片段，序列長(zhǎng)度為810bp，包括完整的cDNA序列699bp和兩端的酶切位點(diǎn)（分別為55bp和56bp）。電泳鑒定PCR產(chǎn)物與所需擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度相符（圖1），測(cè)序結(jié)果與GenBank中標(biāo)準(zhǔn)序列比對(duì)，相似性達(dá)99％。

圖1 GAL全長(zhǎng)cDNA的PCR結(jié)果Fig.1 Electrophoresis of GAL full-length cDNA PCR products

2.2 重構(gòu)分子GAL（intronII）構(gòu)建結(jié)果的鑒定

重構(gòu)分子是GAL全長(zhǎng)cDNA分成的兩部分以及第二內(nèi)含子為模板重疊延伸出來的，長(zhǎng)度為1436bp（圖2）。測(cè)序結(jié)果表明重疊延伸得到片段由GAL全長(zhǎng)cDNA和第二內(nèi)含子組成，第二內(nèi)含子插入的位置準(zhǔn)確，無突變和移碼。

2.3 重組質(zhì)粒pMD19-T Simple/GAL（intronII）的鑒定

pMD19-T Simple/GAL（intronII）用SalI、PstI分步酶切，在電泳圖中泳道1為酶切產(chǎn)物2.7kb和1.4kb的條帶，其中2.7kp的條帶即為pMD19-T Simple載體長(zhǎng)度為2692bp，1.4kb的條帶為GAL（intronII）長(zhǎng)度1436bp。泳道2為沒有酶切的pMD19-T Simple/GAL（intronII）（圖3）。測(cè)序證明酶切得到的條帶即為pMD19-T Simple載體和重構(gòu)分子GAL（intronII）。

圖2 重構(gòu)分子GAL（intronII）的PCR結(jié)果Fig.2 Electrophoresis of GAL（intronII）PCR products

圖3 質(zhì)粒pMD19-T Simple/GAL（intronII）酶切鑒定Fig.3 Electrophoresis of enzyme digestion of plasmid pMD19-T Simple/GAL（intronII）

2.4 重組質(zhì)粒pUC18/PDGF-β-promoter的鑒定

以XbaI和SalI雙酶切重組質(zhì)粒pUC18/PDGF-β-promoter，在電泳圖中泳道1為酶切產(chǎn)物2.7kb和1.5kb的條帶，其中2.7kb的條帶為PUC18載體長(zhǎng)度為2686bp，1.5kb的條帶為PDGF-β啟動(dòng)子片段長(zhǎng)度為1486bp。測(cè)序結(jié)果證明酶切得到的條帶即為PDGF-β啟動(dòng)子片段（圖4）。測(cè)序結(jié)果與Gene Bank中標(biāo)準(zhǔn)序列比對(duì)，相似性達(dá)100％。

圖4 質(zhì)粒PUC18/PDGF-β-promoter酶切鑒定Fig.4 Electrophoresis of enzyme digestion of the recombined plasmid PUC18/PDGF-β-promoter

2.5 重組載體pUC18/PDGF-β-promoter/GAL（intronII）的鑒定

以XbaI和HindIII雙酶切重組質(zhì)粒pUC18/PDGF-β-promoter/GAL（intronII），在電泳圖泳道1為酶切產(chǎn)物2.7kb和3.0.kb的條帶，其中2.7kb的條帶為PUC18載體長(zhǎng)度為2686bp，3.0kb的條帶為1486bp dePDGF-β啟動(dòng)子和1436bp的GAL（intronII）片段連接而得到的轉(zhuǎn)基因片段（圖5）。測(cè)序結(jié)果與理論上的重組片段進(jìn)行比對(duì)，相似性達(dá)到99％。

圖5 質(zhì)粒PUC18/PDGF-β-promoter/GAL（intronII）酶切鑒定Fig.5 Electrophoresis of enzyme digestion of the recombined plasmid PUC18/PDGF-βpromoter/GAL（intronII）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)參照了Holmberg和Kuteeva等的方法，在GAL全長(zhǎng)cDNA插入第二內(nèi)含子，但是插入的位點(diǎn)不同［6］。根據(jù)Barbara等發(fā)表的研究，GAL cDNA的第一外顯子是非編碼序列，第二外顯子編碼了27個(gè)堿基的前導(dǎo)序列，第三外顯子的前15個(gè)堿基編碼了信號(hào)序列。第三外顯子的后39堿基和第四、五，六外顯子編碼了GAL和GAL相關(guān)肽（GMAP），第六外顯子的后150個(gè)堿基為非編碼序列［10］。本研究中嘗試運(yùn)用重疊延伸PCR方法擴(kuò)增的嵌入第二內(nèi)含子的GAL全長(zhǎng)cDNA的是一種嵌合分子，自然不存在，但是并沒有打亂其基因表達(dá)框。早在上世紀(jì)80年代Rochester等在進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植物和動(dòng)物的研究中已經(jīng)開始在cDNA中插入一段內(nèi)含子以增強(qiáng)其表達(dá)。試驗(yàn)表明異源內(nèi)含子（特別是第一、二內(nèi)含子）可提高外源基因（特別是以cDNA為表達(dá)構(gòu)件）的表達(dá)效率［11，12］。Palmiter等進(jìn)行的轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)了發(fā)現(xiàn)含有內(nèi)含子時(shí)能比cDNA的表達(dá)水平提高5～75倍［13］。而國內(nèi)學(xué)者盧一凡等的研究也得出類似的結(jié)論，并且證明了內(nèi)含子插入的位置對(duì)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)沒有影響［14］。

本實(shí)驗(yàn)嘗試了將PCR擴(kuò)增技術(shù)應(yīng)用于DNA片段連接。一般情況下采用限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)連接DNA。本研究在擴(kuò)增GAL全長(zhǎng)cDNA和將第二外顯子插入cDNA時(shí)采用了重疊延伸PCR。這樣既不需要考慮內(nèi)切酶位點(diǎn)，連接效率高，同時(shí)也沒有引入額外堿基，保持了正確的讀碼框，有利于基因表達(dá)。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了兩次重疊，第一次重疊是以cDNA的3個(gè)片段為模板的，所以擴(kuò)增出的片段使重疊部分非常長(zhǎng)，5′和3′重疊的部分分別為83bp和109bp，重疊延伸能有效進(jìn)行；第二次重疊時(shí)內(nèi)含子和切開的cDNA片段的引物中均為重疊部分故有兩端都有50bp的重疊部分，重疊也能有效進(jìn)行。

大量的研究表明GAL在神經(jīng)生理學(xué)過程包括對(duì)促性腺激素的神經(jīng)內(nèi)分泌的調(diào)節(jié)、生長(zhǎng)激素的分泌、認(rèn)知功能和癲癇易感性等過程起了重要作用。近幾年來GAL轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型被不同領(lǐng)域的研究人員用于各種生理病理研究，如疼痛、癲癇、空間學(xué)習(xí)能力等［15-17］。前期，人們對(duì)GAL模型的研究熱點(diǎn)主要集中于闡明這些GAL缺失表達(dá)或者過表達(dá)模型中某些疾病相關(guān)的生理、病理特征［18］。最近，研究者們開始探索GAL在生理病理過程中的作用機(jī)制［19］。GAL的功能是通過GAL受體GALR1，GALR2，GALR3中的一個(gè)或多個(gè)介導(dǎo)的，基于研究的需要，研究人員對(duì)GAL受體進(jìn)行基因修飾構(gòu)建GALR基因敲除模型［20-22］。隨著GAL研究的深入，Lang R提出了GAL家族，包括GAL、GMAP、GAL樣肽、alarin和GAL受體家族［23］。

本研究構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因載體采用一個(gè)在神經(jīng)生理學(xué)模型研究應(yīng)用較為成熟和廣泛的血小板源性生長(zhǎng)因子β鏈啟動(dòng)子來控制GAL在神經(jīng)系統(tǒng)中過量表達(dá)，為構(gòu)建一個(gè)有效的GAL過表達(dá)轉(zhuǎn)基因，模型進(jìn)行GAL的研究奠定了重要的基礎(chǔ)。

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