兩種自發(fā)性2型糖尿病小鼠生物學(xué)特性比較

李 娜，張 周

（中國科學(xué)院上海藥物研究所，上海 201203）

合適的糖尿病動(dòng)物模型在糖尿病的發(fā)病機(jī)制研究及其并發(fā)癥的治療、藥物的開發(fā)過程中都發(fā)揮著極其重要的作用。國內(nèi)外諸多學(xué)者均對(duì)KK小鼠或db/db小鼠的典型糖尿病特征進(jìn)行研究，但卻未對(duì)其進(jìn)行比較分析，故本實(shí)驗(yàn)采用發(fā)病過程與人類糖尿病極其相似的自發(fā)性2型糖尿病動(dòng)物模型KKAy/Ta和C57BL/KsJ-db/db小鼠為研究對(duì)象，對(duì)其體重、血糖、胰島素、臟器系數(shù)以及部分臟器病理學(xué)變化等生物學(xué)特性進(jìn)行分析比較，為糖尿病病因及治療方法的研究提供基礎(chǔ)資料以便選擇合適的動(dòng)物模型。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為4組，分別為：糖尿病模型KK-Ay/Ta（以下簡(jiǎn)稱KK）小鼠及對(duì)照組C57BL/6JSlac（以下簡(jiǎn)稱C57）小鼠，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司［SCXK（滬）2007-0005］；糖尿病模型C57BL/KsJ-db/db（以下簡(jiǎn)稱db/db）小鼠及對(duì)照組C57BL/KsJ-db/+（以下簡(jiǎn)稱db/+）小鼠，由美國JACKSON實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)的db/+小鼠在中國科學(xué)院上海藥物研究所交配繁殖的后代［SCXK（滬）2008-0017］；每組小鼠20只，雌雄各半，飼養(yǎng)于本單位動(dòng)物屏障環(huán)境內(nèi)［SYXK（滬）2008-0049］；溫度控制在20℃～25℃之間，日溫差≤3℃；相對(duì)濕度控制在40％～70％之間；每日12h光照維持，晝夜循環(huán)；自由進(jìn)食、飲水，配合飼料（121℃高溫高壓滅菌25min）含粗蛋白20.5％、粗脂肪4.6％、粗纖維3.0％、鈣1.4％、總磷0.9％，購自上海仕林生物科技有限公司［飼料生產(chǎn)企業(yè)審查合格證編號(hào)：滬飼審（2008）04031］。

1.1.2 試劑：胰島素試劑盒（美國CRYSTAL CHEM公司生產(chǎn)）、甲醛溶液、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉。

1.1.3 儀器設(shè)備：OneTouch UltraTM血糖儀、OneTouch UltraTM試紙、分析天平、電子天平、毛細(xì)管、離心機(jī)、酶標(biāo)儀、顯微鏡。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)周期：KK及對(duì)照組C57小鼠從6周齡開始，實(shí)驗(yàn)至30周齡結(jié)束；db/db及對(duì)照組db/+小鼠從4周齡開始實(shí)驗(yàn)，至20周齡結(jié)束。在各自實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，每2周測(cè)定模型小鼠與對(duì)照組小鼠的體重、血糖、血清胰島素水平；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死，分離心、肝、脾、腎、胰腺、腎周脂肪、皮下脂肪、腸系膜脂肪以及肩胛骨脂肪，稱重并計(jì)算臟器/脂肪系數(shù)；另對(duì)腎臟、肝臟和胰腺進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察。

1.2.2 體重與糖代謝比較：每2周測(cè)定實(shí)驗(yàn)小鼠體重與血糖值，分析比較不同年齡、不同性別的模型組與對(duì)照組小鼠體生長(zhǎng)曲線和糖代謝曲線，分析各模型間達(dá)到血糖值異常的時(shí)間差異及峰值比較；血糖直接采用血糖儀測(cè)定尾靜脈血。

1.2.3 血清胰島素的比較：在各自實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，每2周眼眶采血200μL，3500r/min離心15min，取血清，-20℃保存，采用放射免疫分析法測(cè)定胰島素水平。

1.2.4 主要臟器、脂肪重量及臟器、脂肪系數(shù)的測(cè)定：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，分別處死各實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組小鼠，分離心、肝、脾、腎、胰腺、腎周脂肪、皮下脂肪、腸系膜脂肪以及肩胛骨脂肪，稱重；各臟器和脂肪重量以g為單位，臟器（脂肪）系數(shù)以臟器（脂肪）重量/體重×100％表示。

1.2.5 組織形態(tài)學(xué)觀察：分別將各實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組小鼠的腎臟、肝臟和胰腺固定于10％中性福爾馬林溶液中＞24h，梯度酒精脫水，石蠟包埋，切片，HE染色，用高倍鏡觀察并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)用Mean±SE表示，采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。差異顯著性采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因子方差分析。

2 結(jié)果

2.1 體重的比較

KK和對(duì)照組C57小鼠、db/db和對(duì)照組db/+表型正常小鼠的體重均隨著年齡的增長(zhǎng)而增加，并分別于6周齡和8周齡開始與其對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05），且同品系小鼠間雄性小鼠體重高于雌性，經(jīng)分析可得出：自14周齡開始KK小鼠雌雄間相比差異顯著（P＜0.05），db/db小鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)均呈現(xiàn)顯著差異（P＜0.05）；而兩品系間相比又可得出：KK小鼠體重遠(yuǎn)高于db/db小鼠（P＜0.05），雄性KK小鼠體重最高達(dá)51.21±1.93g，雌性KK小鼠體重最高達(dá)42.73±2.76g；但雄性db/db小鼠則最高達(dá)38.69±3.66g，雌性最高值為35.64±3.48g（表1）。

表1 糖尿病模型KK與db/db小鼠體重（g）Tab.1 Body weight of diabetic KK and db/db mice（g）

2.2 血糖的比較

在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，KK小鼠血糖值與對(duì)照組呈顯著差異（P＜0.05），雄性小鼠在10周齡時(shí)出現(xiàn)血糖異常癥狀（血糖≥13.9mmol/L），之后快速升高于12周齡達(dá)到最高值便逐漸降低但一直維持較高水平直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束；而雌性小鼠于12周齡時(shí)出現(xiàn)血糖異常現(xiàn)象，持續(xù)升高于18周齡達(dá)到最高值；另外，同周齡間的雄性小鼠血糖值明顯大于雌性小鼠（P＜0.05），其最高值分別為31.11±3.10和25.50±2.28mmol/L。db/db小鼠則在8周齡時(shí)就出現(xiàn)血糖異常癥狀并維持至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，同樣雄性小鼠的血糖值遠(yuǎn)大于雌性小鼠（P＜0.05）。db/db小鼠出現(xiàn)血糖異常比KK早，且初期血糖值遠(yuǎn)高于KK小鼠（P＜0.05），雌雄分別于12周齡和18周齡開始與KK小鼠處于相當(dāng)水平，最高值可分別達(dá)到29.92±1.45和27.77±1.70mmol/L（表2）。

2.3 血清胰島素的比較

在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，糖尿病模型KK與db/db小鼠與各自對(duì)照組均呈現(xiàn)顯著的差異（P＜0.05），且KK小鼠從6周齡開始就一直處于高胰島素水平狀態(tài)（≥10ng/mL），并很快達(dá)到峰值，而雄性和雌性db/db小鼠則分別于8周齡和10周齡開始處在高胰島素水平狀態(tài)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束；而同品系的雌雄小鼠間血清胰島素水平則基本上沒有差異（P＞0.05）；另外，同周齡內(nèi)KK小鼠的血清胰島素水平明顯高于db/db小鼠（P＜0.05），雄、雌性KK小鼠的最高值分別為61.99±12.20ng/mL和62.35±15.61ng/mL，db/db小鼠分別為18.84±4.11ng/mL和17.03±3.71ng/mL（表3）。

2.4 主要臟器、脂肪重量及其臟器、脂肪系數(shù)的比較

2.4.1 臟器、脂肪重量比較

由結(jié)果（表4）分析得出，KK小鼠與其對(duì)照組相比，所有臟器、脂肪重量和體重差異顯著（P＜0.05）；同時(shí)，雄性KK小鼠的體重、肝臟、腎周脂肪、皮下脂肪、腸系膜脂肪和肩胛骨脂肪均明顯大于雌性小鼠（P＜0.05）。db/db與其對(duì)照組相比，部分臟器（如雄性的肝臟、脾臟，雌性的心臟、肝臟、脾臟和腎臟）以及所測(cè)脂肪的重量均呈現(xiàn)顯著差異（P＜0.05）；而不同性別的db/db小鼠間除脾臟外，其余臟器以及脂肪重量均沒有顯著差異（P＞0.05）。另外雄性KK小鼠的體重、心臟、脾臟以及胰腺重量明顯大于db/db小鼠（P＜0.05），但皮下脂肪和肩胛骨脂肪的重量則小于db/db小鼠（P＜0.05）；雌性KK小鼠體重、脾臟、胰腺、腎臟的重量大于db/db小鼠（P＜0.05），而腎周脂肪、皮下脂肪和肩胛骨脂肪的重量則遠(yuǎn)小于db/db小鼠（P＜0.05）。

表2 糖尿病模型KK與db/db小鼠血糖（mmol/L）Tab.2 Glucose of diabetic KK and db/db mice（mmol/L）

表3 糖尿病模型KK與db/db小鼠血清胰島素（ng/mL）Tab.3 Serum insulin of diabetic KK and db/db mice（ng/mL）

2.4.2 臟器、脂肪系數(shù)比較

由結(jié)果分析可得出（表5），雄性KK小鼠的脂肪系數(shù)大于雌性小鼠，且均大于對(duì)照組（P＜0.05），但所測(cè)臟器則呈現(xiàn)不同程度的萎縮，尤其是雄性小鼠的心臟和腎臟萎縮程度明顯大于雌性小鼠（P＜0.05）。同樣db/db小鼠的脂肪系數(shù)也大于對(duì)照組（P＜0.05），且脾臟和胰腺也呈現(xiàn)不同程度的萎縮，但是雌雄間則沒有明顯的差異（P＞0.05）。另外db/db和KK小鼠相比表明，db/db小鼠脾臟和胰腺的萎縮程度明顯大于KK小鼠（P＜0.05），而KK小鼠肝臟的萎縮程度則大于db/db小鼠（P＜0.05），同時(shí)db/db小鼠的脂肪系數(shù)則遠(yuǎn)大于KK小鼠（P＜0.05）。

表4 糖尿病模型KK和db/db小鼠的臟器、脂肪重量（g）Tab.4 Organ and adipose weight of diabetic KK and db/db mice（g）

表5 糖尿病模型KK和db/db小鼠的臟器、脂肪系數(shù)（％）Tab.5 Organ and adipose coefficient of diabetic KK and db/db mice（％）

2.5 組織病理學(xué)變化

各糖尿病模型和對(duì)照組相比，腎小球內(nèi)玻璃樣變性、血管基底膜增厚、腎小管腔內(nèi)透明管型、腎小管上皮細(xì)胞脂肪變性，且腎間質(zhì)組織輕度充血、水腫，炎細(xì)胞浸潤(rùn)；肝細(xì)胞大片壞死、伴隨有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)以及纖維組織增生，肝細(xì)胞嚴(yán)重脂肪變性；胰島數(shù)量明顯減少、體積縮小，且島內(nèi)細(xì)胞數(shù)量也相對(duì)減少、體積縮小，部分胰島完全萎縮、崩解（彩圖見封2）。

3 討論

自發(fā)性2型糖尿病動(dòng)物模型是指實(shí)驗(yàn)動(dòng)物未經(jīng)任何有意識(shí)的人工處理、在自然狀態(tài)下發(fā)生以高血糖、胰島素抵抗為主要特征的糖尿病模型，KK-Ay/Ta小鼠和db/db小鼠均是目前應(yīng)用于人類2型糖尿病研究適用的自發(fā)性動(dòng)物模型，KK-Ay/Ta小鼠是一種毛色基因（Ay）突變的2型糖尿病動(dòng)物模型，Ay基因不僅影響小鼠的毛色而且可引起代謝紊亂，出現(xiàn)高飲食［1］、肥胖、高血糖、脂質(zhì)代謝紊亂和和高胰島素血癥；db/db小鼠則是由美國Jackson實(shí)驗(yàn)室于1966年在C57BL/Ks小鼠上發(fā)現(xiàn)的帶有糖尿病突變基因（db）的動(dòng)物，該品系純合子小鼠早期發(fā)育時(shí)就會(huì)出現(xiàn)顯性糖尿病征兆。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)兩種品系糖尿病小鼠的起止周齡不一致，是因?yàn)樽髡呓Y(jié)合國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道以及早期預(yù)實(shí)驗(yàn)而定，如Ito［2］研究得出KK小鼠于12周齡后體重、隨機(jī)血糖等指標(biāo)均明顯高于對(duì)照組，出現(xiàn)典型的2型糖尿病癥狀，另有研究表明db/db小鼠于早期即出現(xiàn)糖尿病癥狀，故本實(shí)驗(yàn)于6周齡和4周齡開始監(jiān)測(cè)KK和db/db小鼠各項(xiàng)指標(biāo)，同時(shí)研究得出db/db小鼠于16周齡即出現(xiàn)血糖和胰島素水平下降癥狀，即于20周齡結(jié)束db/db小鼠的實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)研究得出KK小鼠體重遠(yuǎn)高于db/db小鼠，體重最高值相差可達(dá)12g（雄性）與7g左右（雌性），且與對(duì)照組相比KK小鼠出現(xiàn)顯著差異比db/db小鼠早，于6周齡即出現(xiàn)明顯的體重異常。Amy［3］研究報(bào)道db/db小鼠的最高體重可達(dá)41.10±5.63g，Toshihiro［4］的研究中表明雌雄KK-Ay小鼠的平均體重在45g左右，較db/db小鼠高，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本保持一致。

將血糖值進(jìn)行比較則得出db/db小鼠出現(xiàn)血糖異常比KK早，且發(fā)病早期就呈現(xiàn)高血糖，早期血糖值比KK小鼠高，血糖變化曲線圖穩(wěn)定，而KK小鼠發(fā)病后期可較長(zhǎng)時(shí)間的維持血糖異常，維持時(shí)間較db/db小鼠長(zhǎng)。Amy［3］的研究報(bào)道也表明出db/db小鼠的隨即血糖可達(dá)559±77mg/dl，即31.06±4.28mmol/L；而Satomi［5］研究得出KK小鼠的血糖最高值平均可達(dá)410mg/dl，即22.78mmol/L；同時(shí)Toshihiro［4］的研究也表明KK-Ay小鼠的血糖值可維持在400mg/dl左右。以上結(jié)果均與本實(shí)驗(yàn)基本一致，綜合可得出KK小鼠的血糖值較db/db小鼠要低。

兩品系小鼠均呈現(xiàn)出高胰島素血癥，Tsukuda［6］研究分析該現(xiàn)象是由于大腦中過氧化物酶缺乏，持續(xù)的高胰島素分泌導(dǎo)致胰島素β細(xì)胞分泌較正常多幾倍甚至十幾倍來降低血糖，如此反復(fù)從而導(dǎo)致高胰島素血癥。另外實(shí)驗(yàn)得出KK小鼠出現(xiàn)血清胰島素水平異常比db/db小鼠早，且遠(yuǎn)高于db/db小鼠，從實(shí)驗(yàn)開始就呈現(xiàn)極高的血清胰島素水平狀態(tài)直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。KK小鼠最高可達(dá)60ng/mL，是db/db小鼠最高值的3倍。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物臟器重量和臟器系數(shù)是鑒定動(dòng)物遺傳品質(zhì)的重要依據(jù)［7］。本研究得出兩種糖尿病模型小鼠所有臟器及脂肪重量均明顯大于對(duì)照組，db/db小鼠的脂肪含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過KK小鼠，而部分臟器則出現(xiàn)情況不等的萎縮癥狀，如db/db小鼠脾臟和胰腺的萎縮程度大于KK小鼠，而KK小鼠肝臟的萎縮程度則大于db/db小鼠，以上癥狀均說明這兩種糖尿病模型各自會(huì)影響免疫系統(tǒng)功能如脾臟，以及肝臟和胰腺的功能。

本實(shí)驗(yàn)也得出KK小鼠和db/db小鼠會(huì)出現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞脂肪變性、蛋白管型，腎間質(zhì)組織充血、水腫，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等腎臟病變，可引發(fā)糖尿病腎病，與報(bào)道相符，如Ninichuk等［8］報(bào)道db/db小鼠在晚期會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的腎臟病變、蛋白尿，透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)腺皮質(zhì)線粒體變形、脂滴減少、細(xì)胞核變形、染色質(zhì)邊集等異常病變；王謙等［9］對(duì)28周齡KK-Ay小鼠進(jìn)行病理學(xué)研究分析得出其腎臟系膜增多，腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)出現(xiàn)明顯空泡，腎間質(zhì)纖維化等系列病變。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)還得出這兩種動(dòng)物模型均出現(xiàn)程度不等的肝細(xì)胞大片壞死、大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)以及纖維組織增生，且肝細(xì)胞嚴(yán)重脂肪變性，是研究糖尿病繼發(fā)病-肝臟疾病發(fā)病機(jī)理以及肝病藥物療效的有效動(dòng)物模型，與文獻(xiàn)研究基本一致，如Yu等［10］報(bào)道KK-Ay/Ta小鼠可出現(xiàn)非酒精性脂肪肝，肝臟結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞呈脂肪變形，肝組織纖維化。除此之外，Homo-Delarche［11］報(bào)道Ⅱ型糖尿病動(dòng)物模型在病程早期出現(xiàn)胰島增生肥大，隨病程進(jìn)展逐漸出現(xiàn)胰島數(shù)量減少、體積縮小、β細(xì)胞調(diào)亡，提示胰島β細(xì)胞調(diào)亡是造成胰島β細(xì)胞功能受損的重要原因，引起胰島結(jié)構(gòu)破壞和功能受損，最終引起血糖控制上的惡化，而本研究也表現(xiàn)出晚期的胰島數(shù)量明顯減少、體積縮小，胰島內(nèi)細(xì)胞數(shù)量減少、體積縮小，部分胰島完全萎縮、崩解，呈現(xiàn)β細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致胰島功能受損，血糖控制無力。

綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出，KK-Ay/Ta和C57BL/KsJ-db/db小鼠均是肥胖的，伴有高血糖、高度胰島素抵抗，肝臟、腎臟病變和胰島功能不足的適用性Ⅱ型糖尿病動(dòng)物模型，同時(shí)db/db小鼠早期就表現(xiàn)出血糖異常，且血糖值高、相對(duì)穩(wěn)定，雖然db/db小鼠的體重不及KK小鼠，但是db/db小鼠的脂肪含量明顯多于KK小鼠。而KK小鼠的血糖異常持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，且血清胰島素水平遠(yuǎn)大于db/db小鼠，讀者可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的糖尿病動(dòng)物模型。

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