不同年齡自發(fā)性高血壓大鼠心臟AT2R的表達與心肌纖維化

羅素芬，黃群英，王華軍，晉學(xué)慶

（福建省廈門長庚醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科，廈門 361028）

腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RSA）在調(diào)節(jié)血壓、維持水電解質(zhì)平衡以及某些心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展中，都是極為重要的。近年來，隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)RAS不僅存在于循環(huán)系統(tǒng)中，而且存在于血管、心臟、腎臟等局部組織，通過旁分泌、自分泌和細胞間分泌等形式發(fā)揮作用。血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）是RAS主要活性肽，在血壓調(diào)節(jié)和體液平衡中起重要作用，并且與高血壓發(fā)病機理有關(guān)。AngⅡ的生物學(xué)效應(yīng)是通過與其相應(yīng)受體結(jié)合而實現(xiàn)的。AngⅡ受體主要有AT1R、AT2R兩種。SHR作為原發(fā)性高血壓良好的動物模型，其血壓隨著年齡的增長而逐漸升高，本研究觀察不同月齡自發(fā)性高血壓大鼠心臟AT2R的表達及心肌纖維化，初步探討AT2R在高血壓發(fā)生、發(fā)展過程中的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SHR和WKY由本研究所動物飼養(yǎng)室飼養(yǎng)。飼料由上海必凱公司提供［SCXK（滬）2003-0003］。實驗分組：一月齡組、二月齡組、三月齡組、六月齡組和九月齡組雄性SHR共5組，每組各6只，各組均有相應(yīng)月齡及數(shù)量匹配的WKY大鼠作對照。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組：一月齡組、二月齡組、三月齡組、六月齡組和九月齡組雄性SHR共5組，每組各6只，且各組均有相應(yīng)月齡的WKY大鼠作對照。

1.2.2 血壓的測量：采用RBP-I型大鼠血壓心率測定儀，在大鼠清醒狀態(tài)下間接測量動脈收縮壓（SBP）。

1.2.3 放免法測定血漿AngⅡ水平：按說明書，大鼠斷頭后取血2mL，立即注入預(yù)冷的含酶抑制劑（3.0mmol/LEDTA二鈉，3.4mmol/L8-羥基喹啉，3.2mmol/L二巰基丙醇）的試管中，4℃、3000rpm離心5min，取上清液，-70℃保存。測定采用125I-AngⅡ標記的放射免疫分析，SN-682B-3型放射免疫γ-計數(shù)器記錄結(jié)果。結(jié)果以pg/mL表示。本試劑盒測定范圍10-2000pg/mL，靈敏度為5pg/mL，批內(nèi)變異系數(shù)CVw＜10％，批間變異系數(shù)CVb＜15％，與AngI交叉反應(yīng)率＜0.01％，試劑盒提供的抗體與人心鈉素、降鈣素基因相關(guān)肽以及舒血管腸肽等均無交叉反應(yīng)。

1.2.4 免疫組織化學(xué)（SP法）：甲醛固定的心臟組織經(jīng)石蠟包埋，切片；常規(guī)脫蠟，水化；3％過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶；以1∶3稀釋胰酶修復(fù)抗原；加入一抗（1∶150AT2R），4℃過夜；滴加山羊抗小鼠IgG抗體-HRP多聚體，室溫30min；DAB（北京中山生物技術(shù)有限公司）顯色；蘇木素復(fù)染；脫水，透明，中性樹膠封固。結(jié)果判斷：當胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒染色時判為陽性染色并以染色陽性細胞比例評定陽性表達，利用圖象分析儀（LEICAQ-500），分析測定陽性表達細胞胞漿的染色面積。對照實驗：以1％PBS代替一抗為陰性對照。

1.2.5 心肌膠原

飽和苦味酸天狼星紅染色法使膠原特殊染色，心肌細胞呈黃色，膠原呈紅色。光學(xué)顯微鏡觀察心肌切片心臟內(nèi)膜、心臟外膜及心肌小動脈周圍膠原沉積的情況。

1.3 統(tǒng)計分析

所得的數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示。各組間比較采用單因素方差分析，多個樣本均數(shù)及兩兩比較用ANOVA檢驗。數(shù)據(jù)使用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理。P＜0.05表示有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 不同月齡SHR與WKY血壓的變化

SHR SBP隨著月齡的增加呈持續(xù)上升（P＜0.05），而WKY無類似趨勢（P＞0.05）；S6 SBP明顯高于S1［（180.83±9.70mmHg）VS（132.33±5.61mmHg），P＜0.05］，而S6與S9之間無明顯差異［（180.83±9.70mmHg）VS（188.00±13.19mmHg），P＞0.05］；SHR的SBP均高于相應(yīng)配對的WKY組（P＜0.05）（圖1）。

圖1 不同年齡SHR和WKY血壓。與相比配的WKY比較P＜0.05；與S1比較P＜0.05Fig.1 The SBP of different age SHR and WKY.P＜0.05 VS the same age WKY；P＜0.05 VS S1

2.2 不同月齡SHR與WKY血漿AngⅡ濃度的變化

一個月后SHR血漿AngⅡ水平均高于S1［S2（849.13±24.84pg/mL）、S3（819.60±57.65pg/mL）、S6（897.00±76.99pg/mL）和S9（863.04±91.83pg/mL）VSS1（378.44±35.97pg/mL），P＜0.05］，而S2、S3、S6和S9之間比較無明顯差別（P＞0.05）；WKY各月齡組血漿AngⅡ水平無明顯差別（P＞0.05）；一個月后SHR血漿AngⅡ水平均高于相應(yīng)配對的WKY組（P＜0.05）（圖2）。

圖2 不同年齡SHR和WKY血漿AngⅡ濃度。與相比配的WKY比較P＜0.05；與S1比較P＜0.05Fig.2 The plasma concentration of Ang Ⅱ of different age SHR and WKY.P＜0.05 VS the same age WKY；P＜0.05 VS S1

2.3 不同月齡SHR與WKY心臟AT2R表達的比較

AT2R在心肌內(nèi)外膜均有表達，但含量較少，主要分布在心肌細胞膜上，光學(xué)顯微鏡下胞漿染成棕黃色（封底圖3）。圖象分析示SHR心臟AT2R免疫染色陽性面積比隨著月份的增加而降低，S6、S3及S9明顯降低（P＜0.05），S6和S3比較無明顯差別（P＞0.05）；WKY各月齡組無明顯差別（P＞0.05）。SHR心臟AT2R免疫染色陽性面積比均低于相應(yīng)配對的WKY組（P＜0.05）（圖4）。

圖4 不同年齡SHR和WKY心臟AT2R免疫組化的半定量分析。與相比配的WKY比較P＜0.05；與S1比較P＜0.05；與S2比較P＜0.05Fig.4 Quantification of AT2Rimmunohistochemical staining in heart of different age SHR and WKY.P＜0.05 VS the same age WKY；P＜0.05 VS S1；P＜0.05 VS S2

2.4 不同月齡SHR與WKY天狼星紅心肌膠原含量的比較

大鼠心肌切片用飽和苦味酸天狼星紅染色法使膠原特殊染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察，可見心肌細胞顯黃色，而心肌細胞間和小動脈周圍有紅色的纖維狀沉著，此即為心肌膠原（封底圖5）。SHR天狼星紅心肌膠原染色陽性面積百分比隨著月齡的增加而增加，并均高于相應(yīng)配對的WKY組（P＜0.05），WKY各組間無明顯差別（P＞0.05）（圖6）。

圖6 不同年齡SHR和WKY心臟膠原含量。與相比配的WKY比較，P＜0.05；與S1比較，P＜0.05Fig.6 The content of collagen in the heart of different age SHR and WKY.P＜0.05 VS the same age WKY；P＜0.05 VS S1

3 討論

腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）的過度激活在高血壓及相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起著關(guān)鍵的作用。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)RAS不僅存在于循環(huán)系統(tǒng)中，而且存在于血管、心臟、腎臟等局部組織，通過旁分泌、自分泌和細胞間分泌等形式發(fā)揮作用，在心血管的發(fā)病因素中，局部RAS比循環(huán)RAS更為重要。同時，腎素-血管緊張素系統(tǒng)在高血壓致心肌纖維化的發(fā)病機制中受到廣泛關(guān)注。

血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）是RAS的中心環(huán)節(jié)，通過與其靶細胞表面的特異性受體結(jié)合發(fā)揮作用。AngⅡ受體主要有AT1R、AT2R兩種受體，都屬于7次跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體，兩者最主要的區(qū)別在于AT1R是能被Losartan選擇性抑制的受體，而AT2R是被PD123319選擇性抑制的。在成熟組織中，AT1R介導(dǎo)血管平滑肌細胞、心肌細胞、冠狀動脈內(nèi)皮細胞的生長與增殖［1］，這些作用相互影響，成為高血壓的重要發(fā)病因素。而AT2R的功能目前則了解較少。通過研究AT2R，人們發(fā)現(xiàn)AT2R和AT1R的生物作用大部分相反。AT2R的激活在AT1R拮抗劑治療上起著重要作用［2］，AT1R阻滯劑廣泛應(yīng)用于降壓治療，其降壓機制是通過雙重作用實現(xiàn)的，既阻斷AT1R介導(dǎo)的升血壓作用；同時又使更大量的AngⅡ作用于AT2R，也即增強了AT2R介導(dǎo)的降血壓作用。因而研究AT2R的作用有助于進一步明確AT2R在高血壓發(fā)病中的作用。

AT2R廣泛分布于胎兒組織，成年腦、腎上腺髓質(zhì)、卵巢、子宮、內(nèi)皮細胞、心肌。AT2R與AngⅡ結(jié)合后，使G蛋白激活，進而激活一系列磷酸酶，其中主要激活的MKP-1是絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）特異的磷酸酶，與血管重構(gòu)和高血壓關(guān)系密切。AngⅡ通過AT2R抑制細胞生長，促進細胞凋亡、細胞分化、血管舒張，促進一氧化氮的產(chǎn)生和釋放。在心臟、動脈和腎臟，AngⅡ通過激活A(yù)T2R，刺激NO/cGMP釋放，介導(dǎo)血管舒張，從而對抗AT1R介導(dǎo)的功能并發(fā)揮潛在的保護作用。Ichiki等［3］發(fā)現(xiàn)敲除AT2R基因的小鼠與對照的野生型小鼠相比血管舒張反應(yīng)減弱，動脈壓升高2.67～3.33KPa，且對AT1R介導(dǎo)的加壓反應(yīng)明顯增強，證明AT1R調(diào)節(jié)縮血管作用，而AT2R調(diào)節(jié)擴血管作用，AT2R激活能抑制AT1R介導(dǎo)的升壓作用。Vazquez［4］等研究發(fā)現(xiàn)，在5/6腎臟切除術(shù)動物模型中提前給AT1R拮抗劑氯沙坦治療的動物AT2R表達大大增加，而AT2R拮抗劑PD-123319則減少AT2R表達、增加腎臟損傷和升高血壓，表明AT2R代表著一種反調(diào)節(jié)作用機制來保護局部缺血性腎損傷。Arima等［5］研究發(fā)現(xiàn)：AngⅡ激活兔入球小動脈上的AT2R，引起入球小動脈舒張。剝除血管內(nèi)皮或抑制細胞色素P450途徑，尤其是抑制環(huán)氧二十三烯酸的合成時，可完全抑制這一血管舒張反應(yīng)。AT2R總是下調(diào)由AT1R介導(dǎo)引起的反應(yīng)，結(jié)果是細胞增殖下降、血漿AVP水平下降、對縮血管物質(zhì)的反應(yīng)下降［6］。此外，高血壓發(fā)病過程中，對心臟的影響主要是左心室心肌肥厚，是由于心肌細胞肥大，同時心肌間質(zhì)膠原纖維不成比例的增加［7］。最明顯的是心肌膠原過度合成和沉積，并導(dǎo)致心肌纖維化［8］。高血壓心肌纖維化在形態(tài)上主要表現(xiàn)為心肌間質(zhì)中膠原的異常堆積，其特征為心肌膠原濃度增加或心肌膠原容積分數(shù)增高。Martin Paul和Daniel A等［9，10］分別研究發(fā)現(xiàn)，高血壓心臟病患者不論其心室負荷狀況如何，左右心室都存在心肌纖維化，因而提出血液動力學(xué)并不是心肌纖維化的唯一機制，體液因子、激素和代謝等因素均參與心肌纖維化。而RAS在高血壓致心肌纖維化的發(fā)病機制中受到廣泛關(guān)注，在心臟和血管局部完整的RAS的存在，主要參與血管緊張性與局部功能的調(diào)節(jié)。而AT2R的激活可能主要表現(xiàn)為在心肌組織內(nèi)發(fā)揮作用，產(chǎn)生潛在的擴血管、抗增殖和心肌保護功能。研究表明AT2R介導(dǎo)心肌細胞凋亡，Li Js等［11］在培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞和成纖維細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，AT1R介導(dǎo)細胞生長，對心肌細胞具有營養(yǎng)效應(yīng)，在心室重構(gòu)中起到重要作用，而AT2R興奮則抑制AT1R依賴性生長，AT1R阻斷后可引起培養(yǎng)乳鼠心肌細胞凋亡。

本研究通過觀察自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）其血壓隨著年齡的增長而逐漸升高，心臟AT2R蛋白表達隨著年齡的增加而降低且低于WKY，而WKY的AT2R蛋白表達隨年齡增加無類似趨勢；此外，SHR心肌膠原分布明顯多于同齡WKY大鼠，SHR心肌纖維化隨著年齡的增加而加重。提示AT2R在高血壓發(fā)生、發(fā)展過程中的作用，這將對制定高血壓治療新方案有重要意義。

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