非離子氨和亞硝酸氮對(duì)蝦虎魚仔魚的急性毒性及安全濃度評(píng)價(jià)

林忠婷，李建軍，陳 琳，黃 韌

（廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所，廣州 510260）

在循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中，隨著飼料等外界氮源的不斷加入，養(yǎng)殖水體中無機(jī)氮含量不斷積累，其濃度往往超過水生動(dòng)物的耐受值，從而影響魚類生長(zhǎng)速度，甚至導(dǎo)致死亡。養(yǎng)殖水體中的無機(jī)氮主要以非離子氨、銨態(tài)氮、亞硝酸氮和硝酸鹽氮的形式存在，其中非離子氨和亞硝酸氮的危害最大，是制約高密度養(yǎng)殖模式下魚類正常生長(zhǎng)的主要因子之一。

裸項(xiàng)櫛蝦虎魚（Ctenogobius gymnauchen）為鱸形目、蝦虎魚亞目、蝦虎魚科、蝦虎魚亞科、櫛蝦虎魚屬的一種小型海洋魚類，為廣布暖溫種，分布于我國(guó)沿海，南至琉球、菲律賓一帶的礁石或沙泥底質(zhì)淺水區(qū)。因其個(gè)體小，性成熟早，繁殖周期短，繁殖力強(qiáng)，便于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飼養(yǎng)管理，廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所開展了一系列該魚的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化研究試驗(yàn)［1-3］。魚類早期生命階段是其生命周期中對(duì)外界環(huán)境最敏感的階段，本試驗(yàn)以裸項(xiàng)櫛蝦虎魚仔魚為試驗(yàn)材料，研究了非離子氨和亞硝酸氮對(duì)魚類的急性毒性，旨在為制訂魚類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

裸項(xiàng)櫛蝦虎魚仔魚，廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所培育，第九代，7日齡，健康，其來源、孵化及培育參照GB/T 18420-2009《海洋石油勘探開發(fā)污染物生物毒性第2部分：檢驗(yàn)方法》。

1.2 試驗(yàn)藥品及溶液配制

試驗(yàn)用氯化銨（NH4Cl）和亞硝酸鈉（NaNO2）為分析純，購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠，試驗(yàn)前用稀釋水分別配成4.147 mg/L非離子氨和10.88 g/L亞硝酸氮母液，試驗(yàn)開始時(shí)用稀釋水稀釋成試驗(yàn)所需濃度的暴露溶液。

1.3 試驗(yàn)條件

試驗(yàn)用稀釋水為天然海水，經(jīng)水處理系統(tǒng)過濾和殺菌處理；試驗(yàn)容器為250 m L燒杯，盛試液200 m L，隨機(jī)放入仔魚10尾；試驗(yàn)期間用默克水質(zhì)分析儀（MERCK，型號(hào)：NOVA60）監(jiān)測(cè)非離子氨和亞硝酸氮含量，用溶解氧測(cè)定儀（YSI 550A）、酸度計(jì)（METTLER TOLEDO SevenGo SG2）、電導(dǎo)率儀（METTLER TOLEDO SevenGo SG3）等監(jiān)測(cè)水質(zhì)，試驗(yàn)水溫（25±1）℃、溶氧（6.07～6.77） mg/L、鹽度30～31，pH8.0～8.2；試驗(yàn)期間每尾魚每24 h投喂約500個(gè)褶皺臂尾輪蟲，每24 h更換試驗(yàn)液一次。

1.4 試驗(yàn)方法

首先根據(jù)非離子氨和亞硝酸氮對(duì)其它魚類毒性試驗(yàn)的相關(guān)研究及預(yù)試驗(yàn)結(jié)果設(shè)置5個(gè)濃度組和一個(gè)對(duì)照組，非離子氨濃度梯度設(shè)置為 0、0.413、0.735、1.309、2.329、4.147 mg/L，亞硝酸氮濃度梯度設(shè)置為0、3.0、4.14、5.713、7.884、10.88 g/L，每組設(shè)2個(gè)平行，暴露后觀察記錄仔魚中毒癥狀及死亡情況，及時(shí)撈出死亡仔魚。

1.5 數(shù)據(jù)計(jì)算

用概率單位法求出非離子氨（NH3）96 h LC50。

［4］，用下式計(jì)算其非離子氨濃度（CNH3）：

式中CT為總氨氮濃度；n NH3為非離子氨的物質(zhì)的量；nN為氮的物質(zhì)的量，海水 UIA％值查文獻(xiàn)［4］表4為 3.4％。即在本試驗(yàn)中，CNH3=CT× 4.13％

參考文獻(xiàn)［5］，用下式計(jì)算安全濃度SC：

SC=0.1×96 hLC50

2 結(jié)果

2.1 中毒癥狀觀察

非離子態(tài)氨高濃度組（2.329 mg/L和 4.147 mg/L）和亞硝酸氮高濃度組（7.884 g/L和 10.88 g/L）中的仔魚在72 h后顯得呆滯，游動(dòng)遲緩；80 h后出現(xiàn)側(cè)游；90 h后最高濃度組（非離子氨4.147 mg/L、亞硝酸氮10.88 g/L）部分仔魚呼吸困難、體色變白、身體彎曲，最后死亡。非離子氨組與亞硝酸氮組仔魚死亡情況有所不同，非離子氨組仔魚死亡時(shí)魚體大多從中間向內(nèi)彎曲，仔魚從出現(xiàn)畸形到死亡的過程發(fā)展很快；亞硝酸氮各濃度組中的仔魚死亡前體色漸漸變白，仔魚從體色開始變化到死亡的過程發(fā)展較非離子氨組慢。

2.2 非離子氨和亞硝酸氮對(duì)裸項(xiàng)櫛蝦虎魚仔魚的96hLC50及安全濃度（見表1－4）

3 討論

3.1 非離子氨和亞硝酸氮的致毒機(jī)制

表1 非離子氨對(duì)裸項(xiàng)櫛蝦虎魚仔魚的急性毒性Tab.1 The acute toxicity of non-ion ammonia on larvae of Ctenogobius gymnauchen

表2 亞硝酸氮對(duì)裸項(xiàng)櫛蝦虎魚仔魚的急性毒性Tab.2 The acute toxicity of nitrite on larvae of Ctenogobius gymnauchen

表3 非離子氨對(duì)裸項(xiàng)櫛蝦虎魚仔魚的96 h LC50及安全濃度Tab.3 96 h LC50 and safe concentration of non-ion ammonia on larvae of Ctenogobius gymnauchen

表4 亞硝酸氮對(duì)裸項(xiàng)櫛蝦虎魚仔魚的96 h LC50及安全濃度Tab.4 96 h LC50 and safe concentration of nitrite on larvae of Ctenogobius gymnauchen

水環(huán)境中氨氮的主要來源是含氮有機(jī)物經(jīng)細(xì)菌分解、氨化作用而形成的終產(chǎn)物，其次是水生生物排泄的含氮產(chǎn)物，它包含兩部分，即離子氨（）和非離子氨（NH3），統(tǒng)稱總氨或氨氮，其中非離子氨（NH3）是氨氮中主要毒物［5-9］。當(dāng)水環(huán)境中非離子氨增加時(shí)，會(huì)抑制生物自身氨的排泄量，使血液和組織中氨的濃度升高，降低血液載氧能力；非離子氨（NH3）半徑較小，不帶電荷，為親脂性分子，很容易穿透脂質(zhì)性生物膜的疏水性微孔進(jìn)入生物體內(nèi)，從而對(duì)鰓表皮細(xì)胞造成損傷，降低魚的免疫力，甚至直接使魚類中毒；此外非離子氨能降低魚類的能量代謝活動(dòng)，損害其鰓、肝、腎、脾和甲狀腺組織，使其出現(xiàn)呼吸困難，分泌物增多，甚至衰竭死亡等一系列生理毒性反應(yīng)［5，10］。亞硝酸氮是硝化作用與反硝化作用的一種中間產(chǎn)物，能將血紅蛋白中的二價(jià)鐵氧化成三價(jià)鐵，使血紅蛋白（Hb）轉(zhuǎn)變成不能攜氧的高鐵血紅蛋白（MHb），低濃度的亞硝酸氮可降低水生動(dòng)物的抗病能力［11］，高濃度的亞硝酸氮可抑制血液的載氧能力，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致魚類缺氧而窒息死亡［12］，王明學(xué)等證實(shí)白鰱魚種血液中的高鐵血紅蛋白含量隨NO2-N濃度的升高而增多［13-14］，此外水生生物的非特異性免疫相關(guān)酶對(duì)低濃度的銨氮和亞硝酸氮表現(xiàn)出一定的應(yīng)激反應(yīng)［15］，抗氧化能力也會(huì)受到影響［16-18］。本試驗(yàn)仔魚死亡前出現(xiàn)身體彎曲、體色變白、呼吸困難等癥狀，與上述致毒機(jī)理是相吻合的。

3.2 氨氮和亞硝酸氮的毒性比較

本試驗(yàn)非離子氨和亞硝酸氮對(duì)裸項(xiàng)櫛蝦虎魚仔魚96 h LC50分別為9.1 mg/L和12.405 g/L，明顯高于一些魚類，如非離子氨對(duì)真鯛仔魚96 h LC50為0.28 mg/L［19］、對(duì)大菱鲆96 h LC50為1.14 mg/L（溶氧正常）與1.73 mg/L［20］（溶氧過飽和）；亞硝酸氮對(duì)真鯛仔魚（全長(zhǎng)6±1 mm）96 h LC50為23.74 mg/L［19］、對(duì)大菱鲆的96 h LC50分別為0.13066 g/L（溶氧正常）和0.39078 g/L［23］（溶氧過飽和），其原因除與不同魚類的品種、體質(zhì)、生長(zhǎng)階段以及試驗(yàn)環(huán)境的溫度、鹽度、pH、堿度、溶解氧等因素有關(guān)外，還可能與裸項(xiàng)櫛蝦虎魚為底棲魚類，對(duì)環(huán)境脅迫因子具有較強(qiáng)耐受能力有關(guān)。非離子氨和亞硝酸氮對(duì)裸項(xiàng)櫛蝦虎魚的毒性較低，表明裸項(xiàng)櫛蝦虎魚作為魚類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，具有便于實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)與推廣的優(yōu)勢(shì)。

此外，本試驗(yàn)非離子氨對(duì)裸項(xiàng)櫛蝦虎魚仔魚的毒性強(qiáng)于亞硝酸氮，這和其它文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致［14、19、21-23］。

3.3 仔魚對(duì)銨態(tài)氮和亞硝酸氮的毒性反應(yīng)

仔魚暴露于高濃度非離子態(tài)氨和亞硝酸氮中后先后出現(xiàn)呆滯、側(cè)游、呼吸困難、身體彎曲、體色變白等中毒癥狀，但非離子氨和亞硝酸氮引起仔魚的反應(yīng)不同，非離子氨組仔魚死亡時(shí)魚體大多從中間向腹側(cè)彎曲，仔魚從出現(xiàn)畸形到死亡的過程發(fā)展得很快，而亞硝酸氮各濃度組中的仔魚死亡體色漸漸變白，仔魚從體色開始變化到死亡的過程，發(fā)展較慢，這種情況與鱖魚苗對(duì)銨態(tài)氮和亞硝酸氮的毒性反應(yīng)基本相似，鱖魚苗接觸高濃度銨態(tài)氮和亞硝酸氮后，也出現(xiàn)昏迷、沉落水底，身體彎曲，體色變淡等中毒癥狀，且同樣亞硝酸氮組從體色變淺到死亡的時(shí)間較長(zhǎng)［14］，大菱鲆對(duì)非離子氨和亞硝酸氮也有類似反應(yīng)［20］。上述情況表明非離子氨和亞硝酸氮除共同影響魚類血液載氧能力外，其致毒機(jī)制存在差異，具體機(jī)制差異有待進(jìn)一步研究。

3.4 非離子氨和亞硝酸氮的毒性影響因素

非離子氨（NH3）和亞硝酸氮的毒性取決于水中pH、水溫、鹽度、溶解氧等，pH值增高時(shí)，NH3的比率增大，pH小于7時(shí)，幾乎都以NH+4形式存在，pH大于ll時(shí)幾乎都以NH3形式存在，較高pH值條件下亞硝酸氮的毒性較弱；水溫升高時(shí)NH3的比率增大，毒性增強(qiáng)；鹽度升高時(shí)NH3的比率下降，養(yǎng)殖環(huán)境中亞硝酸氮的毒性降低；增加溶氧可以影響進(jìn)入血液的NO2-N數(shù)量，提高血液的載氧能力和魚體對(duì)NH3的代謝能力，從而降低了亞硝酸氮和NH3的對(duì)魚體的毒性效應(yīng)［10、20-21、24］；在 NaNO2溶液中加入CaC12和NaC1，24 h后魚類死亡率均明顯低于對(duì)照組，且 CaC12對(duì) NO2-N的解毒作用好于 NaC1［25］，Horst等認(rèn)為cl-/NO-2的比值可以抑制亞硝酸氮通過鰓浸入血液中，因而會(huì)降低亞硝酸氮的“表面毒性”［26］，Tomasso等曾經(jīng)報(bào)道斑點(diǎn)叉尾鲴及硬頭鱒對(duì)亞硝酸氮的毒性受 Ca2+濃度的影響很大［27］，王明學(xué)等也認(rèn)為CaC12對(duì)亞硝酸氮誘導(dǎo)草魚魚種血液產(chǎn)生高鐵血紅蛋白的抑制作用明顯高于 NaC1［28］，因此魚類養(yǎng)殖過程中應(yīng)注意上述因素的改善。

參考文獻(xiàn)：

如作家路德維格·菲爾斯（Ludwig Fels）所說，威特金的照片，是“對(duì)一種源自古典時(shí)期的深刻精神性的見證”。威特金的藝術(shù)展現(xiàn)的是人生中那些基本的分類：愛與痛苦，快樂與折磨，愛神與死神。他是我們這個(gè)時(shí)代的攝影師中的哲學(xué)家。

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