豬細小病毒單克隆抗體的制備和鑒定

張 倩，李曉霞，董昕欣，顧小雪，曹 振，鄧小雨，胡冬梅，劉 奇，周 智，遇秀玲，翟新驗，田克恭

（1.中國動物疫病預(yù)防控制中心，北京 100193；2.北京市朝陽區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心，北京 100018）

豬細小病毒（porcine parvovirus，PPV）是引起母豬繁殖障礙的主要病原體之一［1］。該病常發(fā)生在春、秋產(chǎn)仔季節(jié)，以懷孕母豬，特別是初產(chǎn)母豬感染后流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎及新生仔豬死亡為臨床特征，而母體通常缺乏臨診癥狀［2］。自20世紀(jì)60年代中期以來，相繼從歐洲、美洲、亞洲等很多國家分離到該病毒或檢測出其抗體。我國也先后在北京、上海、吉林、黑龍江、四川、浙江、湖北、河南、山東、福建等地分離到了多株P(guān)PV，血清學(xué)調(diào)查陽性率在12.1％ ～84.8％不等。因該病流行面廣、危害嚴重，給養(yǎng)豬業(yè)帶來重大經(jīng)濟損失。

目前已經(jīng)建立了多種檢測PPV的方法，包括病毒分離、分子生物學(xué)診斷技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗等，這些方法在病原檢測或抗體檢測中各有特點，在該病的診斷中發(fā)揮了重要的作用。但如何在此基礎(chǔ)上研制開發(fā)純度高、性能穩(wěn)定的檢測試劑以及更易在生產(chǎn)實踐中推廣應(yīng)用的快速檢測方法仍然是今后豬細小病毒疾病防治工作的一個重點。單克隆抗體以其高度均質(zhì)性、高度特異性，來源穩(wěn)定等特點［3］，可直接運用于疫病的臨床診斷，尤其是臨床疑似病例的病毒抗原檢測，也可作為原材料廣泛應(yīng)用于多種診斷方法。本文旨在制備生物活性好、抗體分泌穩(wěn)定的抗PPV的單克隆抗體雜交瘤細胞株，為豬細小病毒病的臨床快速診斷商品化試劑研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 毒種、細胞和實驗動物

PPV、豬腎細胞（PK-15）和 SP2/0細胞（Sp2/0-Ag14）均購自美國標(biāo)準(zhǔn)菌種保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬偽狂犬病毒（PRV）、豬圓環(huán)病毒I型（PCV-1）、豬圓環(huán)病毒Ⅱ型（PCV-2）、乙腦病毒（JEV）均為中國動物疫病預(yù)防控制中心獸醫(yī)診斷室保存。SPF級BALB/c小鼠購自中國藥品生物制品檢定所實驗動物中心［SCXK（京2005-2004）］。

1.2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基（GIBCO公司）、HAT（Sigma公司，貨號 H0262）、HT（Sigma公司，貨號 H0137）、HRP標(biāo)記的羊抗鼠 IgG（JacksonImmunoResearch，Inc）、HRP標(biāo)記的羊抗鼠 IgM（Jackson Immuno Research，Inc）、FITC標(biāo)記的抗鼠 IgG（Sigma公司）、 FITC 標(biāo)記的抗鼠IgM（Sigma公司）、SBA Clonotyping System/AP kit單抗亞型鑒定試劑盒（Southern Biotechnology Associates，Inc.）。

1.3 病毒增殖與純化

在PK-15細胞傳代后接種PPV，置于37℃5％ C02培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，待75％以上細胞出現(xiàn)細胞病變（CPE）后收毒，收獲的病毒凍融處理3次，然后用聚乙二醇（PEG）濃縮，再經(jīng)差速離心，最后用蔗糖梯度密度離心純化［4］。

1.4 免疫

用純化的PPV與等量的弗氏完全佐劑混勻后，腹腔和背部皮下多點注射SPF級BALB/c小鼠（6～8周齡、雌性）。此后，每間隔兩周用混合弗氏不完全佐劑的抗原液進行加強免疫。兩次加強免疫后，于融合前3天，脾臟或腹腔注射200μg抗原液加強免疫。

1.5 間接ELISA篩選方法的建立

采用間接ELISA方法，按方陣法確定包被PPV純化蛋白抗原、抗體的最適工作濃度。以TMB為底物，測定OD450值。以陽性血清 OD值在1.0左右，同時與陰性血清OD值差距最大的抗原包被濃度、抗體稀釋度為最佳工作濃度。

1.6 細胞融合［3］

將免疫小鼠脾細胞與SP2/0細胞按5∶1比例混合，在50％聚乙二醇作用下融合，融合后置HAT選擇性培養(yǎng)基，將其加入到鋪有飼養(yǎng)細胞的96孔培養(yǎng)板中，置37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.7 陽性雜交瘤細胞的克隆化［5］

對融合后的陽性細胞用有限稀釋法進行4次克隆，使陽性率達100％。將最終篩選出的強陽性單克隆細胞擴大培養(yǎng)，一部分凍存?zhèn)溆?，一部分用于大量制備單克隆抗體。

1.8 單克隆抗體的制備及純化

取8～12周齡SPF級BALB/c小鼠腹腔注射雜交瘤細胞，所得腹水用親和層析法進行純化。

1.9 單克隆抗體的鑒定

1.9.1 雜交瘤細胞染色體分析［6］

按常規(guī)方法進行雜交瘤細胞染色體分析，于高倍顯微鏡下觀察，每份樣本應(yīng)計數(shù)100個完整的中期核細胞，記錄染色體數(shù)目的分布。

1.9.2 單克隆抗體效價及亞型的測定

采用已建立的間接 ELISA方法測定細胞上清及腹水中單克隆抗體的效價。按照SBA Clonotyping System/AP kit單抗亞型鑒定試劑盒說明書進行單克隆抗體亞型的測定。

1.9.3 單克隆抗體特異性鑒定

1.9.3.1 交叉反應(yīng)：以PRRSV、CSFV、PRV、PCV-1、PCV-2、JEV為包被抗原，用腹水分別與其進行交叉檢測，用間接ELISA方法測定OD450nm值。

1.9.3.2 免疫過氧化物酶單層試驗（IPMA）：用PPV同步接種含 PK-15細胞的 96孔培養(yǎng)板，置37℃ 5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后用-20℃無水乙醇固定。按方陣法確定的腹水、HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG （IgM）的最佳工作濃度和反應(yīng)時間進行IPMA檢測，經(jīng)AEC進行底物顯色，蘇木素襯染細胞核后，于顯微鏡下觀察。

1.9.3.3 間接免疫熒光檢測方法（IFA）：細胞板的制備和固定同 1.9.3.2。按方陣法確定的腹水、FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG（IgM）工作濃度和反應(yīng)時間進行IFA檢測，于熒光顯微鏡下觀察。

1.9.4 雜交瘤細胞穩(wěn)定性鑒定

獲得的2個細胞株經(jīng)穩(wěn)定傳代后液氮凍存，1個月后復(fù)蘇，檢測細胞上清抗體效價。再經(jīng)腹腔接種BALB/c小鼠，同樣檢測腹水的抗體效價，并與凍存前效價進行比較。

2 結(jié)果

2.1 病毒增殖與純化

經(jīng)蔗糖梯度密度離心純化后的PPV蛋白濃度為11 mg/m L。

2.2 間接ELISA方法篩選建立雜交瘤細胞株

根據(jù)方陣法確定間接ELISA方法的最佳 PPV純化蛋白抗原包被濃度為2μg/mL，經(jīng)間接 ELISA篩選，4次克隆化獲得2株穩(wěn)定分泌抗PPV單克隆抗體雜交瘤細胞株，命名為2H9、1F9。

2.3 單克隆抗體的鑒定

2.3.1 雜交瘤細胞染色體計數(shù)

雜交瘤細胞染色體在90～110范圍內(nèi)變化，2H9平均98，1F9平均96。該數(shù)值大于脾細胞染色體數(shù)的兩倍，小于脾細胞與骨髓瘤細胞的染色體數(shù)目之和，表明該雜交瘤細胞確為脾細胞與骨髓瘤細胞融合產(chǎn)物。

2.3.2 單克隆抗體效價及亞型測定

2H9、1F9雜交瘤細胞上清的 ELISA抗體效價均在104以上，腹水的ELISA抗體效價均在107以上。2H9的亞型是 IgG1、kappa鏈；1F9的亞型是IgM、kappa鏈。

2.3.3 單克隆抗體特異性鑒定

2.3.3.1 交叉反應(yīng)：間接 ELISA檢測結(jié)果顯示，PRRSV、CSFV、PRV、PCV-1、PCV-2、JEV均不與2H9和1F9腹水發(fā)生交叉反應(yīng)。

2.3.3.2 免疫過氧化物酶單層試驗（IPMA）：腹水1∶400稀釋，HRP標(biāo)記的羊抗鼠 IgG（IgM）1∶80稀釋，AEC顯色時，2株單克隆抗體均能與PK-15細胞中的PPV呈中等強度以上反應(yīng)，可見接種了PPV的PK-15細胞核或細胞漿中出現(xiàn)紅色陽性著染，陰性對照細胞未見陽性反應(yīng)（封底圖1）。

2.3.3.3 間接免疫熒光方法（IFA）：腹水1∶400稀釋，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗鼠 IgG（IgM）1∶100稀釋時，2株單克隆抗體均能與PK-15細胞中的PPV呈中等強度以上反應(yīng)，可見接種了PPV的PK-15細胞核或細胞漿中出現(xiàn)黃綠色熒光，陰性對照孔呈暗紅色未見熒光（封底圖2）。

2.3.4 雜交瘤細胞穩(wěn)定性鑒定

2株雜交瘤細胞經(jīng)穩(wěn)定傳代后液氮凍存，1個月后復(fù)蘇，細胞生長良好，抗體分泌水平與凍存前相同。腹腔接種BALB/c小鼠后可致瘤，并穩(wěn)定地分泌特異性抗體。

3 討論

本研究克隆、篩選、鑒定了2株針對PPV的雜交瘤細胞，經(jīng)鑒定證明其分泌的單克隆抗體生物活性好、特異性高、抗體分泌穩(wěn)定，能大量制備，可作為純度高、性能穩(wěn)定的檢測試劑原材料，也可用于PPV檢測商品化試劑盒的研發(fā)，具有廣闊的市場應(yīng)用前景。

本研究通過對雜交瘤細胞克隆化這一關(guān)鍵步驟的把握，使得所制備的單克隆抗體具有陽性克隆多、穩(wěn)定性好的特點。首先在細胞融合后長至孔底的1/2～1/3時進行克隆，避免了陽性細胞漏檢和染色體丟失情況的發(fā)生。采用操作簡便的有限稀釋法，保證了獲得的雜交瘤穩(wěn)定，抗體分泌效價高。經(jīng)過4次克隆化獲得的雜交瘤陽性率均為100％，ELISA檢測證明2H9、1F9交瘤細胞上清效價均達1∶1×104，腹水效價均達1∶1×107。此外，本研究以純化的PPV全病毒作為免疫原，同時在間接ELISA的篩選過程中設(shè)立了PK-15細胞的陰性對照，以確保得到特異性強、活性好的單抗。特異性試驗證明2H9、1F9具有高度的特異性，只與 PPV反應(yīng)，與PRRSV、CSFV、PRV、PCV-1、PCV-2、JEV等相關(guān)豬病病毒均無交叉反應(yīng)。

目前大部分研究制備的 PPV單抗多經(jīng)由ELISA方法篩選得到，并用于 ELISA抗體檢測，如1992年陸萍等獲得3株抗PPV McAbs的雜交瘤細胞株［7］；1993年余太尉篩選出 4株分泌抗 PPV McAbs的雜交瘤細胞系，并用以建立檢測PPV抗體的ELISA［8］；1995年謝琴等得到5株分泌抗 PPV McAbs，用以建立檢測 PPV的 ELISA方法［9］等。而本研究獲得的2株單克隆抗體不僅ELISA效價高，且同時經(jīng)IPMA和IFA方法驗證，均能與接種于PK-15細胞的PPV發(fā)生特異性反應(yīng)，具有良好的免疫酶活性和熒光活性，因此應(yīng)用范圍更廣，不僅可用于建立ELISA方法進行PPV抗體或抗原檢測，還可用于建立簡單、快速、特異、敏感的IPMA和IFA檢測方法。下一步，將利用本研究制備的2株P(guān)PV單抗建立免疫酶和免疫熒光方法，并應(yīng)用于可疑的流產(chǎn)和死產(chǎn)胎兒的腎、肺、肝、腦、睪丸和胎盤等臨床樣品冰凍切片的檢測，作為PCR等豬細小病毒病臨床快速診斷方法的補充和驗證。Infect Dis Rev，2000，2：99-109.

［2］吳丹，仇華吉，李昌文等.豬細小病毒sY一99株非結(jié)構(gòu)蛋白NSl基因的克隆及序列分析［J］.哈爾濱中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報07-2002.

［3］徐志凱.實用單克隆抗體技術(shù)［M］.西安：陜西科學(xué)技術(shù)出版社，1992.

［4］殷震，劉景華主編.動物病毒學(xué)［M］.第二版.北京：科學(xué)技術(shù)出版社.1997，310-318

［5］James W.Goding.Monoclonal Antibodies：Peinciples and practice.Academic press.Inc.Ltd.1983

［6］鄂征主編.組織培養(yǎng)和細胞生物學(xué)技術(shù)（第一版）［M］.北京：北京出版社.

［7］陸萍，胡志賢，王國豐，等.抗豬細小病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株的建立及初步應(yīng)用［J］.上海農(nóng)學(xué)院學(xué)報，1992，10 （2）：101-107.

［8］俞太尉，丘惠深.抗豬細小病毒單克隆抗體的研制及初步應(yīng)用的研究［J］.中國畜禽傳染病.1993，1：55-57.

［9］謝琴，王東，何存利，等.分泌豬細小病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株的建立［J］.中國畜禽傳染病.1995，5：48-50.