實(shí)驗(yàn)小鼠在癌癥研究中的應(yīng)用及其進(jìn)展

王 碩，蘇 杭，袁經(jīng)權(quán)，繆劍華

(1.廣西藥用植物研究所姚新生院士重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530023；2.廣西醫(yī)科大學(xué)，南寧 530021；3.廣西中醫(yī)學(xué)院，南寧 530001)

1902～1908年 Jensen［1］使用實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行腫瘤移植方面的研究，開始確立了小鼠在癌癥研究中潛在的價(jià)值。小鼠體型小、繁殖周期短、產(chǎn)仔數(shù)多、容易飼養(yǎng)、腫瘤生長迅速，且遺傳資源極為豐富。到目前為止，已培育出400多個(gè)近交系小鼠，發(fā)現(xiàn)了大量突變基因［2-3］。近 20多年來，轉(zhuǎn)基因小鼠［4］、基因敲除小鼠［5］等遺傳工程小鼠相繼培育成功。小鼠基因組測(cè)序工作也已經(jīng)完成，并且發(fā)現(xiàn)，小鼠的基因組和人類基因組序列非常相似，幾乎所有人類基因都可以在小鼠身上找到同源基因［6］，由此推斷，只要克隆出與人類腫瘤形成有關(guān)的基因就可以克隆出小鼠相應(yīng)的基因，用于人類腫瘤生物學(xué)及腫瘤預(yù)防、治療研究。反之，通過研究小鼠基因又可以更加深刻地了解人類基因的功能。在小鼠的基因組中發(fā)現(xiàn)并定位了許多癌基因、腫瘤抑制基因，這是其它動(dòng)物(如果蠅、線蟲或大鼠)模型所無法比擬的，決定了小鼠是研究人類腫瘤理想的模型動(dòng)物。因此，了解小鼠的生物學(xué)特性、癌癥研究中常用的普通小鼠模型、GEM模型及利用這些GEM癌癥模型取得的最新進(jìn)展等，對(duì)研究人類癌癥非常有益，本文就這些方面的內(nèi)容加以綜述。

1 腫瘤研究中常用的小鼠模型

1.1 自發(fā)和誘發(fā)腫瘤模型

自發(fā)性小鼠腫瘤模型是指小鼠未經(jīng)任何有意識(shí)的人工處理，在自然情況下產(chǎn)生腫瘤?，F(xiàn)有的近交系小鼠中，有許多品系是自發(fā)的高癌品系。如AKR小鼠，6～8月齡淋巴細(xì)胞性白血病自發(fā)率高達(dá)70%～80%；C3H/He小鼠乳腺癌發(fā)生率在繁殖雌鼠中為97%。使用這些小鼠可以研究人類腫瘤的發(fā)生及特性。

誘發(fā)腫瘤模型是使用致癌物質(zhì)或放射線在一定條件下誘發(fā)小鼠腫瘤，是實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)研究常用的方法。誘發(fā)性腫瘤分為物理因子誘導(dǎo)，化學(xué)誘導(dǎo)和病毒誘導(dǎo)三類。可能誘發(fā)腫瘤的物理因子極多，幾乎所有的放射性元素在實(shí)驗(yàn)中均能引發(fā)腫瘤，尤以放射性超鈾元素為最明顯。1941年 Loreny和Stewart［7］首次發(fā)現(xiàn)用二甲葸或甲基膽葸喂養(yǎng)的小鼠會(huì)產(chǎn)生小腸腫瘤，隨后人們發(fā)現(xiàn)許多化合物均具有致癌性，主要有多環(huán)芳烴類、亞硝胺類、偶氮染料及黃曲霉素等，而膽汁酸和手術(shù)可為輔助致癌因素，能誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生腫瘤?？烧T發(fā)腫瘤的病毒有FB· RFB及鼠肉瘤病毒，Moloney鼠骨肉瘤病毒(MSV)，SV40病毒 (SV40)，郭霍氏桿菌病毒(BKV)等，致瘤率多在80%以上［8］。

自發(fā)和誘發(fā)小鼠腫瘤模型是在自然條件下發(fā)生的腫瘤，其發(fā)病特征和人類腫瘤很相似，涉及遺傳和環(huán)境等因素，理論上講是很理想的動(dòng)物模型，對(duì)研究人類腫瘤有很高的價(jià)值，是研究腫瘤生物學(xué)和開發(fā)腫瘤預(yù)防藥物的重要模型。但是因?yàn)樵撃Ｐ陀绊懸蛩囟?，成瘤時(shí)間長，均一性差，病理癥狀出現(xiàn)較晚，很難定時(shí)作對(duì)比研究，也有發(fā)病率低和穩(wěn)定性差的問題，不能建立比較精確的用于腫瘤研究和藥物篩選的要求規(guī)則、整體的模型，且來源較困難，不可能大量獲得，故在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的很少。

1.2 可移植腫瘤模型

小鼠自發(fā)瘤可移植性腫瘤模型就是將自發(fā)性腫瘤(腫瘤細(xì)胞株)移植到同品系、同品種或異種動(dòng)物體內(nèi)建立的荷瘤小鼠模型。

同種異體移植是在同種或同系動(dòng)物身上移植，供體和受體間的共性大，容易在機(jī)體內(nèi)停留及生長繁殖，再現(xiàn)其腫瘤過程。如，用近交系小鼠 L-1210白血病瘤細(xì)胞株，接種于同品系小鼠皮下或腹腔，可導(dǎo)致小鼠白血病。目前按此種方法建立的小鼠腫瘤模型用于腫瘤研究的有：小鼠結(jié)腸腺癌CT-26，小鼠肉瘤 S-180，小鼠淋巴細(xì)胞白血病 L-1210和P388，艾氏腹水瘤，小鼠網(wǎng)織細(xì)胞白血病615，未分化膠質(zhì)瘤G422，黑色素瘤B-16，F(xiàn)riehd病毒白血病，小鼠肝癌H22，小鼠乳腺癌M5076等，在腫瘤研究中具有重要的意義。

同種移植可供選擇使用的細(xì)胞系或細(xì)胞株較多，許多細(xì)胞系在世界范圍分布廣泛，并且這些細(xì)胞的生物學(xué)特性已經(jīng)比較明確，一般都有明確的背景資料，使群動(dòng)物同時(shí)接種同樣量的瘤細(xì)胞，生長速度一致，個(gè)體差異較小，成活率高，易于對(duì)照觀察，早期腫瘤的發(fā)生類似自發(fā)瘤，特征明顯、重復(fù)性好，移植的腫瘤細(xì)胞生物特性較穩(wěn)定，這些都是便于科研成果相互比較和交流的有利因素，故成為國內(nèi)外常用的腫瘤動(dòng)物模型復(fù)制方法之一。但是，可移植的腫瘤細(xì)胞株沒有遺傳背景的改變，它的生長受周圍組織影響，與人類自然發(fā)生的腫瘤不同，因此，移植瘤模型在篩選作用于實(shí)體瘤的藥物上需要尋找新的突破。

裸小鼠的發(fā)現(xiàn)是人類在癌癥研究中的一個(gè)重要突破，從此，可以把人類的腫瘤移植到小鼠身上進(jìn)行研究。在此之前，人類腫瘤只能接種到動(dòng)物免疫特許的區(qū)域，如眼窩、腦內(nèi)、頰囊等部位，操作不方便，最終還要被排斥。1966年發(fā)現(xiàn)的裸小鼠［9］和1983年發(fā)現(xiàn)的小鼠嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠(SCID小鼠)［10］，都是單基因隱性突變形成。裸小鼠無毛、無胸腺，T細(xì)胞免疫功能缺陷；SCID小鼠淋巴結(jié)、胸腺變小，缺少完成 Ig和 T細(xì)胞受體基因重組的功能，因而其T、B細(xì)胞免疫功能嚴(yán)重缺乏。因?yàn)槁阈∈蠛蚐CID小鼠免疫缺陷，人類的腫瘤和免疫活性細(xì)胞很容易在它們體內(nèi)生長而不被排斥。如，將人胎兒的組織移植到SCID小鼠，人組織在SCID小鼠體內(nèi)保持正常的結(jié)構(gòu)和功能，用這個(gè)攜帶有部分人體組織微環(huán)境的“SCID-human”小鼠模型，可以研究人類腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，以及人癌細(xì)胞與人體組織環(huán)境之間的關(guān)系［11］。

裸鼠和SCID小鼠皮下是移植人類腫瘤的理想位置，操作簡單，是體內(nèi)篩選抗癌藥物主要選擇的部位。目前，人類大多數(shù)腫瘤在裸鼠體內(nèi)移植成功。移植瘤的特性、宿主因素、接種部位、激素和宿主性別的依賴性等都影響人類腫瘤裸鼠移植效果?？赡苁怯捎谒拗鞯种谱饔?特別是 NK細(xì)胞的活性)，裸鼠皮下移植的人類腫瘤很少發(fā)生轉(zhuǎn)移和侵襲臨近組織，但卻保持人類腫瘤的形態(tài)和生化特征。在腫瘤異體移植方面，有人認(rèn)為SCID小鼠是比裸鼠更適合人類癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的動(dòng)物模型，并且在研究人類腫瘤生物學(xué)和評(píng)估腫瘤治療方法上有獨(dú)到之處［12］。

原位移植腫瘤，即將腫瘤細(xì)胞移植于與腫瘤原發(fā)部位相同的裸鼠臟器內(nèi)。原位移植動(dòng)物模型是目前最常用的提高腫瘤自發(fā)轉(zhuǎn)移率的模型，因?yàn)槟[瘤細(xì)胞的生長需要同源組織間質(zhì)細(xì)胞的支持［13］，原位移植腫瘤模型中腫瘤的微環(huán)境與原來器官相似，所以比單純皮下移植等非同源一直的轉(zhuǎn)移率高［14］。腫瘤細(xì)胞植入皮下等非同源器官很難建立符合人類腫瘤自然轉(zhuǎn)移規(guī)律的動(dòng)物模型，因?yàn)榉峭唇M織微環(huán)境對(duì)腫瘤細(xì)胞生長影響較大，而同源組織的微環(huán)境對(duì)腫瘤細(xì)胞生長影響較小。1991年 Fu等［15］利用結(jié)腸癌病人的腫瘤標(biāo)本建立了裸鼠結(jié)腸癌原位移植轉(zhuǎn)移模型，1993年 Furukawa等［16］用完整胃癌組織塊法建立了裸鼠胃癌原位移植模型，1996年我國學(xué)者孫肪憲［17］建立了裸鼠原位移植高轉(zhuǎn)移癌癥模型。有些腫瘤只有將其進(jìn)行原位移植才能表型出轉(zhuǎn)移表型，如人腎癌細(xì)胞KG-2細(xì)胞接種于裸鼠腎臟時(shí)，可以發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，而接種于裸鼠皮下時(shí)則表現(xiàn)轉(zhuǎn)移里喪失［18］。這些研究結(jié)果表明接種的微環(huán)境對(duì)于異質(zhì)性生長的腫瘤中選擇遇有轉(zhuǎn)移能力的細(xì)胞亞群具有重要影響。在腫瘤原位移植模型中，組織學(xué)完整的腫瘤塊原位移植法比腫瘤細(xì)胞懸液原位注射法轉(zhuǎn)移發(fā)生率高，可信性高［19-20］。原位移植腫瘤模型不僅可以為腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究提供幫助，而且可以更真實(shí)地反映抗腫瘤策略的效果。

可移植腫瘤模型應(yīng)用廣泛，因其容易操作，動(dòng)物成瘤穩(wěn)定，均一性好，發(fā)病率高，成瘤時(shí)間差異不大，容易施加干擾因素等特點(diǎn)，仍是目前研究最多的腫瘤模型。

1.3 遺傳工程小鼠模型

隨著人們對(duì)機(jī)體分子、細(xì)胞生物學(xué)特性及遺傳工程研究的深人和與之相關(guān)的研究方法的改進(jìn)，以上腫瘤模型不能滿足全方位研究腫瘤的需要，腫瘤基因模型應(yīng)運(yùn)而至。腫瘤基因模型目前研究使用的主要有以下二種。

轉(zhuǎn)基因腫瘤模型，轉(zhuǎn)基因腫瘤動(dòng)物模型是指借助基因工程技術(shù)將確定的腫瘤外源基因通過生殖細(xì)胞或早期胚胎干細(xì)胞導(dǎo)入宿主的染色體上，在其基因組內(nèi)穩(wěn)定地整合導(dǎo)入的外源腫瘤基因，并能遺傳給后代的一類腫瘤動(dòng)物。1980年，Gordon［4］首次利用雄性前核注射的方法制作成功轉(zhuǎn)基因小鼠，隨后，前核注射、逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)等作為重要基因操作手段在生物醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。正常細(xì)胞惡性病變的根本原因在于基因突變，從基因水平研究腫瘤的形成、發(fā)展與演進(jìn)，開創(chuàng)了腫瘤研究的新紀(jì)元。分子克隆技術(shù)、微注射技術(shù)等高科技的出現(xiàn)，為轉(zhuǎn)基因腫瘤動(dòng)物模型的建立鋪平了道路。

基因敲除腫瘤模型，基因敲除是通過同源重組技術(shù)將外源基因引入胚胎干細(xì)胞，然后將胚胎干細(xì)胞注射到胚胎的胚囊中，后代是攜帶外源基因的嵌合體動(dòng)物，通過繁殖、選擇，可得到純合帶有靶突變基因敲除或基因替換的小鼠［5］。Es細(xì)胞打靶技術(shù)建立的第一個(gè)抑癌基因動(dòng)物模型是P53-/-小鼠，隨后又建立了PgP、hns2、P27KIP、erbB2、Vim、IL-7、ATM等動(dòng)物模型。這些模型在探討腫瘤發(fā)病機(jī)制，診斷、預(yù)防及基因治療等方面起到了不容忽視的作用。

利用轉(zhuǎn)基因和基因敲除技術(shù)，幾乎可以把所有的變異引入小鼠基因組，包括將基因功能全部去除的全突變或點(diǎn)突變。此外，還可造成復(fù)雜的染色體重組，如大區(qū)域缺失、轉(zhuǎn)位及倒位［21］。通過小的干擾RNA封閉內(nèi)源基因的表達(dá)，也已經(jīng)制作成功基因封閉小鼠［22］。轉(zhuǎn)基因技術(shù)日新月異，使得我們能夠制作出更復(fù)雜、更類似于人類癌癥發(fā)病過程的GEM模型［23-25］。一旦某個(gè)人類疾病基因被克隆，很容易組建一個(gè)在相應(yīng)基因中有相同突變的小鼠。由于人類的遺傳結(jié)構(gòu)在許多方面和小鼠非常接近，我們把一些重要的與人類癌癥相關(guān)的基因，利用遺傳工程技術(shù)在小鼠基因組中作一定的改變，小鼠也因此會(huì)發(fā)生類似的病理改變，這樣的GEM就可以作為研究人類癌癥的模型。GEM模型與人類癌癥患者的表型有相似之處，可用于研究人類癌癥發(fā)生、發(fā)展、診斷、治療、新藥開發(fā)等。

轉(zhuǎn)基因腫瘤模型和基因敲除腫瘤模型建立在離體和在體相結(jié)合的基礎(chǔ)上，在分子和細(xì)胞水平上進(jìn)行操作，由動(dòng)物整體水平產(chǎn)生效應(yīng)，因此使我們更完整的去探討腫瘤的遺傳發(fā)病機(jī)制、腫瘤細(xì)胞與機(jī)體之間的免疫學(xué)關(guān)系、腫瘤的發(fā)展演變及凋亡。目前，已經(jīng)培育了大量的攜帶人類癌基因、抑癌基因的GEM品系，建立了小鼠腫瘤模型遺傳學(xué)和病理學(xué)資源數(shù)據(jù)庫［3］。

GEM模型在腫瘤研究上具有其它模型無法比擬的優(yōu)勢(shì)。如腫瘤在小鼠器官內(nèi)的形成是自然發(fā)生的，不是異體移植的；腫瘤的自然生長率和轉(zhuǎn)移特性與人類相似；腫瘤在自然宿主體內(nèi)沒有免疫原性，克服了宿主對(duì)腫瘤的排斥作用。因此，GEM模型比前面幾種小鼠模型更適合于人類腫瘤生物學(xué)的研究。但是，GEM模型也不能完全真實(shí)地模擬人類腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。如，將癌基因?qū)氲叫∈蠡蚪M之后，癌基因往往過早的在不止一種細(xì)胞類型中過度表達(dá)，而人類的癌基因多在中老年后在一種細(xì)胞類型中表達(dá)、發(fā)展成癌。因此，在一些應(yīng)用研究領(lǐng)域(如抗癌藥物篩選方面)，GEM模型還沒有得到充分利用。目前很多癌基因及原癌基因本身的定位、結(jié)構(gòu)及其功能尚不清楚，仍然在不斷地探索階段，因此所建立的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物成功率相對(duì)較低。這種模型盡管發(fā)生率很低，實(shí)際操作上也有許多問題尚在探索中，卻讓我們看到了曙光。

2 小鼠腫瘤模型的局限性

小鼠是嚙齒類動(dòng)物，而人類屬于靈長類，二者的遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)，從小鼠模型得到的結(jié)果有時(shí)候難以外推到人類。如，Marsoni等［26］分析了 1970～1985年NCI進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗(yàn)的75種藥物，發(fā)現(xiàn)利用小鼠移植腫瘤模型篩選的抗腫瘤藥物只有30%在臨床上有活性，說明移植腫瘤動(dòng)物模型并不能很好的反映藥物的臨床活性。移植腫瘤不是腫瘤的原發(fā)部位，而且與宿主組織之間缺乏類似于人類腫瘤和臨近組織的相互作用。此外，使用小鼠研究人類腫瘤的局限性還表現(xiàn)在免疫性、感染等方面。由于存在對(duì)異體移植腫瘤的免疫性，使得普通小鼠模型在免疫治療和腫瘤疫苗研究方面應(yīng)用價(jià)值不大。實(shí)驗(yàn)小鼠感染的一些病毒(如小鼠肝炎病毒、小鼠肺炎病毒)也可能影響腫瘤接種效果或模型表型變化。種的差異性也是所有動(dòng)物模型都遇到的問題。有些生物學(xué)特性可能不存在種間的交叉性，這就要求使用與人類親緣關(guān)系比較接近的動(dòng)物(如非人靈長類)模型或者其它系統(tǒng)。小鼠與人類存在著一定的差異，使小鼠癌癥模型只能部分反映人類癌癥的特性［27］。

3 小鼠腫瘤模型的展望

理想的動(dòng)物模型應(yīng)該能良好地模擬疾病的自然狀態(tài)，并能體現(xiàn)出疾病的主要特點(diǎn)，雖然目前建立的模型較多，但是沒有一種模型能完全滿足研究者的需要，相對(duì)而言GEM模型是目前眾多模型中較為理想的模型。

在藥物研究方面，一年使用幾百萬只小鼠篩選抗腫瘤藥物的途徑可能會(huì)被更有效的體外篩選方法所取代。但是，在人類腫瘤研究方面，目前還沒有更好的方法能夠完全替代動(dòng)物模型。當(dāng)篩選出有效的和感興趣的藥物時(shí)，進(jìn)行臨床前的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是不可回避的。在克服異體移植腫瘤模型缺陷方面，GEM癌癥模型似乎顯示了很大的潛力，但能否真正用在抗癌藥物的篩選上，還有待于進(jìn)一步研究［23］。隨著制作GEM策略的不斷完善，小鼠腫瘤模型將越來越復(fù)雜，非侵入的小鼠腫瘤的成像技術(shù)是需要研究的重點(diǎn)領(lǐng)域之一。如，用特殊的成像系統(tǒng)，檢測(cè)基因的表達(dá)情況、確定抗癌藥物是否到達(dá)靶點(diǎn)，以追蹤治療效果等。計(jì)算機(jī)X射線斷層掃描、磁共振成像、正電子發(fā)射斷層攝影術(shù)等已經(jīng)用在小鼠腫瘤成像上［24］。新的特殊的腫瘤細(xì)胞標(biāo)記技術(shù)也在不斷發(fā)展，如小鼠腫瘤細(xì)胞表達(dá)綠熒光蛋白，在熒光下可以直接觀察到腫瘤細(xì)胞［28］。這些成像技術(shù)的不斷改進(jìn)，將對(duì)研究腫瘤原發(fā)部位、腫瘤轉(zhuǎn)移以及藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用等帶來希望。今后，人類癌癥研究最重要的模型仍將是GEM研究重點(diǎn)可能集中在采用更理想的策略開發(fā)GEM模型以及模型標(biāo)準(zhǔn)化、模型應(yīng)用范圍擴(kuò)大等領(lǐng)域。隨著研究的深入以及各種技術(shù)的完善，人們將逐漸發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)病機(jī)制、腫瘤與宿主的關(guān)系、腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移過程，從而建立起與人腫瘤疾病更相近的動(dòng)物模型。

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