G-CSF干預(yù)對(duì)老齡慢性腦缺血大鼠模型認(rèn)知改善與膠質(zhì)細(xì)胞可塑性的影響

舒細(xì)記 柳 威 周紅艷 陳 瑩 陳艷華 熊巍鵬 艾永循

(江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室,湖北 武漢 430056)

慢性腦血管疾病是人類非自然死亡和致殘的主要原因之一,慢性腦缺血是多種老年慢性腦血管疾病的共同病理過(guò)程,可致中樞神經(jīng)細(xì)胞缺失與功能障礙〔1,2〕。粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor,G-CSF)作為骨髓干細(xì)胞的動(dòng)員劑,可動(dòng)員外周血骨髓干細(xì)胞向中樞神經(jīng)系統(tǒng)遷移,分化成神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞,促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的修復(fù)。目前已有 G-CSF干預(yù)急性腦缺血〔3,4〕或局灶性腦缺血〔5,6〕損傷后神經(jīng)細(xì)胞再生的相關(guān)研究,但針對(duì)慢性腦缺血損傷后膠質(zhì)細(xì)胞可塑性的研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)構(gòu)建慢性腦缺血老齡鼠模型,從認(rèn)知功能改善和星形膠質(zhì)細(xì)胞可塑性改變的角度,探討G-CSF對(duì)老齡鼠海馬慢性腦缺血損傷的神經(jīng)修復(fù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性 SD大鼠 35只,鼠齡 12個(gè)月,體重(360±45)g,由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供。構(gòu)模后符合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求的15個(gè)月老齡鼠有 27只。

1.2 藥物及試劑 重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(商品名瑞白)齊魯制藥有限公司產(chǎn)品;膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)單克隆抗體,Maxim Biotech公司產(chǎn)品;二步法免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒,PV-9000,GBI公司產(chǎn)品。

1.3 慢性腦缺血模型的建立與實(shí)驗(yàn)分組 采用 1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(35～40 mg/kg),分離并永久結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈(two-vessel occlusion,2VO),構(gòu)建 2VO模型。假手術(shù)組(Sham)方法同上,僅分離但不結(jié)扎 2VO作為對(duì)照。將行 2VO術(shù)及 Sham組大鼠術(shù)后飼養(yǎng) 3個(gè)月。符合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求(2VO、術(shù)后存活 3個(gè)月以上,即鼠齡 15個(gè)月以上)的 2VO模型鼠 17只,分為 2VO/G-CSF組 (10只)、2VO/生理鹽水(NS)組 (7只)。Sham組大鼠存活 10只。G-CSF干預(yù)劑量為 10μg/kg,NS的安慰劑量約為 0.1 ml/只(對(duì)照組 NS的劑量盡量與治療組使用 G-CSF的容積一致),均皮下注射,連續(xù) 3d,停藥 5d,完成水迷宮實(shí)驗(yàn)后立即處死大鼠,取材制作組織切片。

1.4 學(xué)習(xí)記憶能力評(píng)估 水迷宮實(shí)驗(yàn)采用成都泰盟MT-200 Morris水迷宮視頻跟蹤系統(tǒng)。其中,定位航行實(shí)驗(yàn)評(píng)估其空間學(xué)習(xí)能力,空間探索實(shí)驗(yàn)評(píng)估其空間記憶能力。適應(yīng)性訓(xùn)練:正式實(shí)驗(yàn)前1 d大鼠在無(wú)逃逸平臺(tái)的水池中適應(yīng)性游泳2 min。定位航行實(shí)驗(yàn):連續(xù) 5 d,每日上午將大鼠面向池壁從不同象限入水,找到平臺(tái)后站立 15 s,記錄其找到隱匿平臺(tái)所耗的逃逸時(shí)間,再?gòu)钠脚_(tái)上移開休息 60 s后進(jìn)行下一輪實(shí)驗(yàn)。如果大鼠在 120 s內(nèi)未找到平臺(tái),在操作者的引導(dǎo)下上平臺(tái),逃逸時(shí)間記為 120 s?？臻g探索實(shí)驗(yàn):完成定位航行實(shí)驗(yàn)后撤去平臺(tái),將大鼠從平臺(tái)所在的對(duì)面象限中放入水池,記錄 2 min內(nèi)大鼠穿過(guò)平臺(tái)所在區(qū)域的次數(shù)及停留于平臺(tái)所在象限的時(shí)間。

1.5 組織病理學(xué)檢查與圖像分析 4%多聚甲醛全身灌注固定,海馬取材定位于前囟后 3.7 mm處,取含海馬組織制片,蘇木素-伊紅(HE)染色。免疫組化染色。采用即用型 GFAP抗體及 PV-9000試劑盒完成,設(shè) PBS為陰性對(duì)照,已知陽(yáng)性切片為陽(yáng)性對(duì)照,GFAP以細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕色顆粒為陽(yáng)性。免疫熒光染色取同部位的相鄰切片,采用 Hoechst 33258染色液室溫下染色,凋亡細(xì)胞以細(xì)胞核呈致密藍(lán)染顆粒為準(zhǔn)。采用MOTIC公司 Med 6.0系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析。全部樣本在 40倍視野選取目標(biāo)區(qū)域 CA 1區(qū),再在高倍鏡下(400倍)隨機(jī)選定起始區(qū)后連續(xù)采集 5個(gè)高倍視野,每個(gè)視野選取 10個(gè)胞質(zhì)突起完整的 GFAP陽(yáng)性細(xì)胞,用標(biāo)準(zhǔn)網(wǎng)格記錄GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),同時(shí),每個(gè)待測(cè)細(xì)胞取最長(zhǎng)的一個(gè)胞質(zhì)突起,記錄其測(cè)量長(zhǎng)度(μm)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用 SPSS13.0及 Excel2003軟件,數(shù)值以±s表示。定位航行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)方差分析的最小顯著差(LSD)法進(jìn)行組間比較,其他數(shù)據(jù)采用單因素方差分析,空間記憶功能與星形膠質(zhì)細(xì)胞可塑性的相關(guān)性分析采用Pearson法。

2 結(jié) 果

2.1 常規(guī)病理組織學(xué)觀察 相對(duì)于 Sham組,2VO/NS組老齡鼠海馬 CA 1區(qū)錐體細(xì)胞排列稀疏而紊亂,GFAP陽(yáng)性細(xì)胞胞質(zhì)突起分支少而短小,部分胞質(zhì)突起崩解消失,毛細(xì)血管壁附近有較多的 GFAP陽(yáng)性細(xì)胞突起。相對(duì)于 2VO/NS組,2VO/GCSF組錐體細(xì)胞胞體增大,胞漿豐富,細(xì)胞排列層數(shù)增多,而GFAP陽(yáng)性細(xì)胞的胞質(zhì)突起明顯纖長(zhǎng),分支增多。

2.2 GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量的變化 海馬 CA 1區(qū) GFAP陽(yáng)性細(xì)胞 2VO/NS組(25.53±7.17)顯著少于 Sham組(63.79±11.57),兩者的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=7.93,P＜0.05);顯示2VO老齡鼠模型中存在慢性腦缺血損傷。海馬CA1區(qū) GFAP陽(yáng)性細(xì)胞 2VO/G-CSF組(36.47±6.21)明顯多于 2VO/NS組,兩者的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.21,P＜0.05)。

2.3 GFAP陽(yáng)性細(xì)胞胞質(zhì)突起的變化 2VO/NS組海馬 CA1區(qū) GFAP陽(yáng)性細(xì)胞的胞質(zhì)突起明顯縮短、分支減少,平均長(zhǎng)度(157.43±19.27)μm,明 顯 短 于 Sham組 〔(243.31±53.34)μm〕,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=9.68,P＜0.05)。2VO/GCSF組 GFAP陽(yáng)性細(xì)胞的胞質(zhì)突起分支多而纖長(zhǎng),平均長(zhǎng)度(189.11±37.01)μm,明顯長(zhǎng)于 2VO/NS組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=7.82,P＜0.05)。

2.4 G-CSF對(duì)老齡缺血大鼠認(rèn)知功能的干預(yù)作用 定位航行實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),隨著訓(xùn)練次數(shù)的增加,各組大鼠找到隱匿平臺(tái)的逃逸時(shí)間呈逐漸縮短的趨勢(shì)。2VO/NS組的逃逸時(shí)間高于 Sham組(F=72.58,P＜0.01)。2VO/G-CSF組逃逸時(shí)間顯著低于2VO/NS組(F=153.40,P＜0.01)?？臻g探索實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),2VO/NS組大鼠停留于平臺(tái)所在象限的時(shí)間(8.90±4.51)s低于Sham組(15.63±4.35)s(P＜0.05);2VO/NS組大鼠跨越平臺(tái)所在區(qū)域的次數(shù)(3.55±1.07)少于 Sham組(8.77±3.64)(P＜0.01)。2VO/G-CSF組大鼠停留于平臺(tái)所在象限的時(shí)間(15.35±4.21)s高于 2VO/NS組(P＜0.01);2VO/G-CSF組大鼠跨越平臺(tái)次數(shù)(8.52±2.68)明顯多于 2VO/NS組(P＜0.01)。見(jiàn)表 1。

表1 各組大鼠定位航行的逃逸時(shí)間(±s,s)

與 Sham組比較:1)P＜0.01;與 2VO/NS組比較:2)P＜0.05,3)P＜0.01

組別 n 第1天 第 2天 第3天 第 4天 第5天Sham組 10 66.12±7.33 45.08±6.91 31.07±5.26 22.15±3.53 16.03±2.29 2VO/NS組 7 94.98±14.751) 78.52±13.111) 64.95±11.381) 43.05±4.371) 29.17±1.631)2VO/G-CSF組 10 81.53±8.092) 54.24±9.033) 43.93±7.083) 29.03±4.813) 19.55±2.463)

2.5 老齡缺血大鼠認(rèn)知功能改善與膠質(zhì)細(xì)胞可塑性的相關(guān)性分析 2VO/NS組、2VO/G-CSF組、Sham組的空間記憶改善趨勢(shì)與對(duì)應(yīng)的膠質(zhì)細(xì)胞可塑性變化的相關(guān)性分析顯示:各組海馬CA1區(qū) GFAP陽(yáng)性細(xì)胞胞質(zhì)突起的長(zhǎng)度變化與各組對(duì)應(yīng)停留時(shí)間的變化趨勢(shì)(R=0.697,F=0.645,P＜0.05)、穿過(guò)平臺(tái)區(qū)域次數(shù)的變化趨勢(shì)(R=0.624,F=0.619,P＜0.05)均呈正相關(guān);各組老齡缺血大鼠海馬 CA 1區(qū) GFAP陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量變化與對(duì)應(yīng)的停留于平臺(tái)所在象限的時(shí)間變化趨勢(shì)(R=0.711,F=7.593,P＜0.05)、穿過(guò)平臺(tái)區(qū)域的次數(shù)變化趨勢(shì)(R=0.731,F=8.754,P＜0.05)呈正相關(guān)。提示海馬膠質(zhì)細(xì)胞可塑性與空間記憶能力改善密切相關(guān)。

3 討 論

2VO是慢性腦缺血的理想模型,2VO可致大腦持續(xù)性低血流灌注,但腦組織未見(jiàn)明顯的壞死區(qū),也未見(jiàn)明顯的運(yùn)動(dòng)功能障礙,如肢體癱瘓等中樞運(yùn)動(dòng)神經(jīng)系統(tǒng)損傷癥狀,與人類慢性腦缺血的病理過(guò)程相似〔7〕。慢性腦缺血類疾病多好發(fā)于老年人,本研究對(duì) 12月齡大鼠開始 2VO手術(shù),持續(xù)低血流灌注 3個(gè)月,實(shí)際觀察分析時(shí)已是 15月齡的 2VO老齡鼠。以往研究構(gòu)建的腦缺血模型較少考慮年齡對(duì)缺血損傷的影響,本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ团c臨床癥狀較為吻合。G-CSF對(duì)于造血細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化起重要介導(dǎo)作用,具有刺激骨髓干細(xì)胞增殖、分化、成熟以及介導(dǎo)細(xì)胞毒作用、趨化作用等生物學(xué)功能。海馬與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān),是腦缺血損傷最敏感的區(qū)域之一,其損傷可以導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能障礙。

本研究在行為學(xué)層面,通過(guò)定位航行實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),G-CSF干預(yù)后慢性腦缺血大鼠的逃逸時(shí)間顯著縮短,空間學(xué)習(xí)能力明顯改善?？臻g探索實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),G-CSF干預(yù)后慢性腦缺血大鼠停留于平臺(tái)所在象限的時(shí)間及跨越平臺(tái)次數(shù)均顯著增多,空間記憶能力明顯改善。提示G-CSF可有效改善慢性腦缺血所致的認(rèn)知功能障礙。在病理組織學(xué)層面,就海馬錐體細(xì)胞增生而言,本研究發(fā)現(xiàn) G-CSF干預(yù)后海馬CA 1區(qū)錐體細(xì)胞胞體增大,胞漿豐富,細(xì)胞排列層數(shù)明顯增多。就海馬膠質(zhì)細(xì)胞可塑性而言,星形膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP為其特異性分子標(biāo)記物)為海馬區(qū)最主要的膠質(zhì)細(xì)胞,星形膠質(zhì)細(xì)胞具有通過(guò)改變自身特性適應(yīng)損傷刺激的能力,即可塑性,其表型上的可變性包括:細(xì)胞數(shù)量上的增加,細(xì)胞胞體、胞核大小及突起長(zhǎng)度的變化,其中以胞質(zhì)突起長(zhǎng)度變化最為明顯〔8,9〕。本研究中 Sham組 GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量最多、胞質(zhì)突起長(zhǎng)度最長(zhǎng),2VO/G-CSF組次之,2VO/NS組最次(部分GFAP陽(yáng)性細(xì)胞胞質(zhì)突起甚至崩解)。Sham組與 2VO/NS組、2VO/G-CSF組與 2VO/NS組的 GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量及胞質(zhì)突起長(zhǎng)度的組間分析,前者提示慢性腦缺血對(duì)海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞的損傷作用,后者提示G-CSF可有效促進(jìn)海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞的可塑性變化。本研究對(duì) G-CSF干預(yù)后空間記憶改善與膠質(zhì)細(xì)胞可塑性進(jìn)行相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)大鼠停留于平臺(tái)所在象限的時(shí)間、穿過(guò)平臺(tái)區(qū)域的次數(shù)與海馬 GFAP陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量及其胞質(zhì)突起長(zhǎng)度均呈正相關(guān),進(jìn)一步提示,G-CSF干預(yù)后的星形膠質(zhì)細(xì)胞可塑性變化與認(rèn)知改善密切相關(guān)。

認(rèn)知障礙改善主要在于海馬神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞的修復(fù)。本研究中 G-CSF干預(yù)后星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增加,胞體增大,胞質(zhì)突起長(zhǎng)度增加、分支增多。新生星形膠質(zhì)細(xì)胞的可塑性改變,一方面可為神經(jīng)細(xì)胞遷移提供腳手架,促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞間突觸網(wǎng)路的建立,還可釋放出興奮性氨基酸、前列腺素等神經(jīng)活性物質(zhì)調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞的功能〔10,11〕。另一方面,也可促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞間的信息交流傳遞,并與神經(jīng)元相互作用,影響神經(jīng)元的生物活性,在神經(jīng)信息傳遞、整合和調(diào)控過(guò)程中起關(guān)鍵作用〔12,13〕。由此推斷,G-CSF干預(yù)后星形膠質(zhì)細(xì)胞的可塑性變化與錐體細(xì)胞增生一樣,也是認(rèn)知功能改善的重要病理修復(fù)機(jī)制。此外,有學(xué)者〔14〕提出在腦缺血干預(yù)的時(shí)機(jī)上存在“多個(gè)治療機(jī)會(huì)窗”的概念,包括腦缺血前初級(jí)預(yù)防機(jī)會(huì)窗、次級(jí)預(yù)防機(jī)會(huì)窗、腦缺血超早期干預(yù)機(jī)會(huì)窗以及腦缺血損傷后的恢復(fù)期和修復(fù)期可能存在的“治療機(jī)會(huì)窗”。本研究是在大鼠持續(xù)性缺血 3個(gè)月后給予 G-CSF干預(yù)的,結(jié)果表明,在錯(cuò)失前期預(yù)防、早期干預(yù)的情況下,在持續(xù)腦缺血時(shí)間較長(zhǎng)的損傷后期也是重要的補(bǔ)救治療機(jī)會(huì)窗。

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