番石榴葉內(nèi)生真菌Pestalotiopsis zonata次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究

王艷穎， 羅都強(qiáng)， 師寶忠， 楊小龍

(河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院藥物化學(xué)與分子診斷教育部省部共建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北保定071002)

番石榴Psidium guajava L為桃金娘科Myrtaceae番石榴屬Psidium植物，為常綠灌木或小喬木，又名番秸、雞屎果和番桃等。番石榴原產(chǎn)于南美洲熱帶地區(qū)，現(xiàn)廣泛分布于熱帶及亞熱帶地區(qū)，在我國(guó)廣東、廣西、福建、海南、臺(tái)灣等省區(qū)均有野生及人工栽培［1］。番石榴葉具有明顯的降血糖、抗病毒及抗菌等活性，其中含有多種化學(xué)成分，迄今從中已分離并獲得的有三萜類(lèi)、黃酮類(lèi)、鞣質(zhì)類(lèi)、倍半萜類(lèi)等成分［2］。近年來(lái)，植物內(nèi)生真菌的研究已成為一大熱點(diǎn)，很多研究者已從植物的內(nèi)生真菌中分離得到與宿主相同或相似的生理活性成分。Pestalotiopsis zonata為擬盤(pán)多毛屬Pestalotiopsis真菌，本實(shí)驗(yàn)首次對(duì)寄生在番石榴葉中的P.zonata的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行了化學(xué)成分的研究，以期對(duì)其藥用活性成分開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)資料，從中分離鑒定了12個(gè)已知化合物，所有化合物均尚未見(jiàn)從該內(nèi)生真菌中分離得到的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

1 儀器與材料

Bruker AVANCE III-600核磁共振譜儀;EI，ESI和FAB-MS:APEIII FT-MS質(zhì)譜儀;Waters600-2489高效液相色譜儀;柱色譜硅膠和制備薄層色譜硅膠GF254均為青島海洋化工產(chǎn)品;反相硅膠(ODS-A);Sephadex LH-20。

該菌株由浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院張敬澤教授提供(2004年5月采自海南興隆，P.zonata分離自番石榴葉部)。

2 發(fā)酵培養(yǎng)

培養(yǎng)基:葡萄糖20 g，去皮土豆200 g，MgSO41.5 g，KH2PO43 g，VB110 mg，加水?dāng)嚢杌旌现? 000 mL。透明三角瓶(大小:500 mL，培養(yǎng)基體積:300 mL)共接種30 L。檸檬酸0.1 g/mL，調(diào)pH值6.0～6.5，溫度:21～23℃，轉(zhuǎn)速:150 r/min，于搖床上培養(yǎng)發(fā)酵2周。

3 提取分離

發(fā)酵液30 L濃縮至4 L左右，用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液減壓回收乙酸乙酯，獲得粗提物17.48 g，上硅膠柱(石油醚-乙酸乙酯-甲醇梯度洗脫)，得到若干不同極性組分，對(duì)其進(jìn)一步分離純化，具體方法有正、反相硅膠柱色譜，Sephadex LH-20(氯仿-甲醇=1∶1與純甲醇兩類(lèi))，HPLC，重結(jié)晶和制備型薄層色譜(PTLC)等，進(jìn)而從提取物中得到化合物Ⅰ(5.8 mg)、Ⅱ(6.6 mg)、Ⅲ (6.3 mg)、Ⅳ(9.2 mg)、Ⅴ(7.8 mg)、Ⅵ (7.1 mg)、Ⅶ (6.5 mg)、Ⅷ (8.2 mg)、Ⅸ (7.4 mg)、Ⅹ (11.5 mg)、Ⅺ(10.4 mg)、Ⅻ (9.1 mg)。

4 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物Ⅰ:白色粉末 (甲醇)。EI-MS m/z:456［M］+;1H-NMR(CD3OD，600 MHz)δH:7個(gè)甲基峰分別為0.88(s)，0.94(d，J=5.9 Hz)，0.97(d，J=6.3 Hz)，1.00(s)，1.01(s)，1.22(s)，1.24(s)，2.49(1H，d，J=11.2 Hz，H-18)，3.31(1H，dd，J=5.4，11.3 Hz，H-3α)，5.43(1H，t，J=7.0 Hz，H-12);13C-NMR(CD3OD，150 MHz)δC:39.6(t，C-1)，28.2(t，C-2)，78.3(d，C-3)，39.5(s，C-4)，55.9(d，C-5)，18.9(t，C-6)，33.8(t，C-7)，40.1(s，C-8)，48.1(d，C-9)，37.6(s，C-10)，23.7(t，C-11)，125.3(d，C-12)，139.2(s，C-13)，42.6(s，C-14)，28.8(t，C-15)，24.7(t，C-16)，48.7(s，C-17)，53.6(d，C-18)，39.7(d，C-19)，39.3(d，C-20)，31.1(t，C-21)，37.2(t，C-22)，28.9(q，C-23)，15.8(q，C-24)，16.6(q，C-25)，17.5(q，C-26)，24.0(q，C-27)，179.5(s，C-28)，17.6(q，C-29)，21.4(q，C-30)。由以上數(shù)據(jù)分析，并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道［3］，確定該化合物為烏蘇酸(ursolic acid)。

化合物Ⅱ:白色粉末(甲醇)。EI-MS m/z:456［M］+;1H-NMR(CD3OD，600 MHz)δH:5.26(1H，t，J=6.8 Hz，H-12)，3.99(1H，m，H-3)，3.33(1H，dd，J=4.0，10.8 Hz，H-18)，0.85，0.89，1.01，1.03，1.21，1.24，1.94(3H ×7，s，Me);13C-NMR(CD3OD，150 MHz)δC:39.8(t，C-1)，27.9(t，C-2)，79.8(d，C-3)，40.6(s，C-4)，56.8(d，C-5)，19.6(t，C-6)，33.9(t，C-7)，39.9(s，C-8)，48.6(d，C-9)，38.2(s，C-10)，24.0(t，C-11)，123.7(d，C-12)，144.9(s，C-13)，42.9(s，C-14)，28.9(t，C-15)，24.1(t，C-16)，47.7(s，C-17)，42.8(d，C-18)，47.3(t，C-19)，31.7(s，C-20)，34.9(t，C-21)，33.6(t，C-22)，28.9(q，C-23)，16.4(q，C-24)，15.9(q，C-25)，17.8(q，C-26)，26.4(q，C-27)，180.2(s，C-28)，33.9(q，C-29)，24.6(q，C-30)。由以上數(shù)據(jù)分析，并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道［4］，確定該化合物為齊墩果酸(oeanlic acid)。

化合物Ⅲ:白色針狀結(jié)晶(甲醇)。1H-NMR(CDCl3，600 MHz)δH:5.28(1H，t，J=6.8 Hz，H-12)，4.49(1H，t，J=8.0 Hz，H-3)，2.05(3H，s，OAc)，0.76，0.86，0.88，0.91，0.94，0.95，1.14(3H ×7，s，Me);13C-NMR(CDCl3，150 MHz)δC:38.1(t，C-1)，22.9(t，C-2)，80.9(d，C-3)，37.7(s，C-4)，55.3(d，C-5)，18.2(t，C-6)，33.8(t，C-7)，39.3(s，C-8)，47.6(d，C-9)，37.0(s，C-10)，23.4(t，C-11)，122.5(d，C-12)，143.6(s，C-13)，41.6(s，C-14)，32.6(t，C-15)，23.5(t，C-16)，46.5(s，C-17)，40.9(d，C-18)，45.8(t，C-19)，30.6(s，C-20)，32.4(t，C-21)，27.6(t，C-22)，28.0(q，C-23)，16.6(q，C-24)，15.3(q，C-25)，17.2(q，C-26)，25.9(q，C-27)，184.3(s，C-28)，33.0(q，C-29)，23.5(q，C-30)，170.9(s，C-31)，21.2(q，C-32)。由以上數(shù)據(jù)分析，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道［5］，確定該化合物 3-乙酰氧基齊墩果酸(3αacetoxyoleanic acid)。

化合物Ⅳ:白色粉末(氯仿)。EI-MS m/z:262［M］+;1H-NMR(CDCl3，600 MHz)δH:5.18(2H，s，H-3)，6.62(1H，s，H-4)，4.60(1H，d，J=6.7 Hz，H-1'a)，4.57(1H，s，H-1'b)，5.49(1H，t，J=6.7 Hz，H-2')，4.03(3H，s，OMe-7)，2.15(3H，s，Me-6)，1.75(3H，s，Me-3'-1)，1.81(3H，s，Me-3'-2);13C-NMR(CDCl3，150 MHz)δC:169.0(s，C-1)，68.7(t，C-3)，109.5(s，C-3a)，99.5(d，C-4)，157.8(s，C-5)，120.8(s，C-6)，163.6(s，C-7)，148.1(s，C-7a)，62.1(q，OMe-7)，8.7(q，Me-6)，65.8(t，C-1')，119.0(d，C-2')，138.6(s，C-3')，18.3(q，Me-3'-1)，25.8(q，Me-3'-2)。由以上數(shù)據(jù)分析，并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道［6］，確定該化合物為 7-甲氧基-6-甲基-5-(3-甲基丁-2-烯-1-基氧代)異苯并呋喃-1(3H)-酮。

化合物Ⅴ:無(wú)色針晶(甲醇)。EI-MS m/z:152［M］+;1H-NMR(CD3OD，600 MHz)δH:7.11(2H，br d，J=8.5 Hz，H-2，6)，6.71(2H，br d，J=8.5 Hz，H-3，5)，3.43(2H，s，H-7);13C-NMR(CD3OD，150 MHz)δC:124.9(s，C-1)，129.7(d，C-2，6)，114.3(d，C-3，5)，155.2(s，C-4)，40.3(t，C-7)，174.6(s，C-8)。由以上數(shù)據(jù)分析，并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道［7］，確定該化合物為對(duì)羥基苯乙酸。

化合物Ⅵ:無(wú)色晶體(甲醇)。1H-NMR(CD3OD，600 MHz)δH:7.03(2H，d，J=8.4 Hz，H-4，8)，6.72(2H，d，J=8.4 Hz，H-5，7)，3.70(2H，t，J=7.2 Hz，H-1)，2.73(2H，t，J=7.2 Hz，H-2);13C-NMR(CD3OD，150 MHz)δC:62.3(t，C-1)，38.1(t，C-2)，115.9(s，C-3)，129.6(d，C-4，8)，114.8(d，C-5，7)，155.3(s，C-6)。由以上數(shù)據(jù)分析，并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道［8］，確定該化合物為酪醇，即對(duì)羥基-β-苯乙醇。

化合物Ⅶ:無(wú)色油狀(氯仿)。1H-NMR(CDCl3，600 MHz)δH:4.46(1H，dd，J=4.9，10.8 Hz，H-2)，3.13(1H，dd，J=4.3，13.9 Hz，H-3a)，2.97(1H，dd，J=6.8，13.9 Hz，H-3b)，7.21-7.30(1H，m，H-2'，3'，4'，5'，6')，3.77(3H，s，OMe);13C-NMR(CDCl3，150 MHz)δC:174.6(s，C-1)，71.3(d，C-2)，40.6(t，C-3)，136.3(s，C-1')，128.6(d，C-2'，6')，129.5(d，C-3'，5')，126.9(d，C-4')，52.5(q，OMe)。由以上數(shù)據(jù)分析，并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道［9］，確定該化合物為2-羥基-3-苯基丙酸甲酯。

化合物Ⅷ:無(wú)色針晶(甲醇)。ESI-MS m/z:399［M-H］-;1H-NMR(CD3OD，600 MHz)δH:0.68(3H，s，Me-18)，1.01(3H，s，Me-19)，0.92(3H，d，J=6.7 Hz，Me-21)，0.84(3H，d，J=5.3 Hz，Me-26)，0.80(3H，d，J=5.3 Hz，Me-27)，0.79(3H，d，J=7.2 Hz，Me-28)，3.49(1H，m，H-3)，5.35(1H，d，J=2.4 Hz，H-6)。由以上數(shù)據(jù)分析，并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道［10］，確定該化合物為菜油甾醇。

化合物Ⅸ:無(wú)色結(jié)晶(甲醇)。FAB-MS m/z:117［M-H］-;1H-NMR(CD3OD，600 MHz)δH:2.56(4H，m，2CH2);13C-NMR(CD3OD，150 MHz)δC:175.8(s)，31.0(t)。由以上數(shù)據(jù)分析，并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道［11］，確定該化合物為琥珀酸。

化合物Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ分別與對(duì)照品β-谷甾醇，過(guò)氧麥角甾醇，D-阿洛醇共薄層色譜檢識(shí)Rf值相同，HPLC檢識(shí)保留時(shí)間一致，因此，確定這3個(gè)化合物分別為β-谷甾醇，過(guò)氧麥角甾醇和D-阿洛醇。

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