B淋巴細(xì)胞刺激因子參與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制及其靶向治療藥物研究進(jìn)展Δ

劉云潔，張玲玲，魏偉（安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所/抗炎免疫藥理學(xué)省部共建教育部重點實驗室/抗炎免疫藥物安徽省工程技術(shù)研究中心，合肥市 230032)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid arthritis，RA）是一種可致殘的系統(tǒng)性自身免疫病，其主要特征是通過慢性炎癥過程導(dǎo)致人體多處活動性小關(guān)節(jié)滑膜的破壞，從而降低患者的生活質(zhì)量，縮短患者的壽命。其發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，許多研究證實[1]，B淋巴細(xì)胞功能紊亂在RA發(fā)病機(jī)制中有著重要的作用。腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor，TNF）家族的成員及其受體是重要的免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)器，而B淋巴細(xì)胞刺激因子（B lymphocyte stimulator，BLyS）作為TNF家族的新成員在B淋巴細(xì)胞的成熟和存活過程中起到非常重要的作用[2]。大量研究[3]證實，BLyS的過表達(dá)與RA等自身免疫病的發(fā)病機(jī)制和疾病進(jìn)程有密切聯(lián)系。因此，BLyS被認(rèn)為是非常理想的治療RA的作用靶點。本文就BLyS的生物學(xué)特性、參與RA的發(fā)病機(jī)制以及靶向于BLyS治療RA的新藥研究進(jìn)展綜述如下。

1 BLyS是調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞增殖活化的重要作用因子

BLyS是一種Ⅱ型跨膜蛋白，由285個氨基酸組成。人的BLyS基因編碼定位于染色體13q34，而小鼠定位于8號染色體[4]。BLyS主要由骨髓來源的細(xì)胞產(chǎn)生，包括中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等[5]。BLyS既能以膜結(jié)合的形式發(fā)揮作用，也可以在弗林蛋白酶的作用下水解為可溶性的細(xì)胞因子[6]。一些細(xì)胞因子如干擾素γ（Interferon gamma，IFN-γ）和白細(xì)胞介素-10（Interleukin-10，IL-10），對弗林蛋白酶所介導(dǎo)的BLyS釋放具有正性調(diào)節(jié)作用[4]。弗林蛋白酶水解產(chǎn)生的可溶性三聚體形式是BLyS在體內(nèi)發(fā)揮功能的主要效應(yīng)器，但BLyS還能以60聚體的形式存在，這使BLyS與受體結(jié)合的能力增強(qiáng)，尤其是與跨膜激活、鈣調(diào)節(jié)和親環(huán)素配體相互作用因子（Transmembrane activator and CAML-interactor，TACI）[7]。

能與BLyS結(jié)合的受體有3個，分別是TACI受體、B細(xì)胞成熟抗原（B cell maturation antigen，BCMA）受體以及B細(xì)胞活化因子受體（B cell activating factor receptor，BAFF-R）。這3種受體都是Ⅰ型跨膜蛋白，屬于TNF家族受體。BCMA和BAFF-R主要表達(dá)在B淋巴細(xì)胞上，而TACI受體被發(fā)現(xiàn)表達(dá)于B淋巴細(xì)胞和活化的T淋巴細(xì)胞。BCMA和TACI還能與增殖誘導(dǎo)配體（A proliferation-inducing ligand，APRIL）結(jié)合，而BAFF-R為BLyS的特異性受體。BLyS就是與這3個特殊的細(xì)胞表面受體結(jié)合從而影響B(tài)淋巴細(xì)胞的增殖和激活[8]。

BLyS可介導(dǎo)外周未成熟B淋巴細(xì)胞（2型B淋巴細(xì)胞，即T2B淋巴細(xì)胞）的存活，使T2B淋巴細(xì)胞經(jīng)B細(xì)胞抗原受體分化為成熟B淋巴細(xì)胞，通過誘導(dǎo)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)促進(jìn)B淋巴細(xì)胞存活，并在生發(fā)中心形成，在自身抗體的產(chǎn)生和類型轉(zhuǎn)換中發(fā)揮重要作用[9]。

動物實驗[10]發(fā)現(xiàn)，BAFF-R表達(dá)缺乏的小鼠表現(xiàn)為T2B淋巴細(xì)胞和成熟B2淋巴細(xì)胞（T細(xì)胞依賴性細(xì)胞）數(shù)大量減少；而分別缺乏TACI和BCMA，或這2種受體聯(lián)合缺乏的小鼠，則擁有正常的甚至是增加的成熟B淋巴細(xì)胞群。這一遺傳學(xué)證據(jù)表明，BAFF-R受體介導(dǎo)了BLyS依賴的B淋巴細(xì)胞存活。BLyS/BAFF-R信號系統(tǒng)通過誘導(dǎo)核轉(zhuǎn)錄因子κB（Nuclear factor-κB，NF-κB）和Bcl-2，使其作用于B淋巴細(xì)胞發(fā)育過程的轉(zhuǎn)變期并誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞分化標(biāo)記CD21、CD23表達(dá)，從而發(fā)揮抗凋亡作用[11]。

研究[12]發(fā)現(xiàn)，BLyS的刺激作用能夠激活2條相互獨立的信號通路——Akt/mTOR和蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶Pim-2，這2個蛋白都與細(xì)胞的生長和存活有關(guān)。新鮮離體的B淋巴細(xì)胞在體外培養(yǎng)時通常會發(fā)生萎縮，但BLyS能阻斷細(xì)胞容積的丟失，同時還能增強(qiáng)糖酵解活動度和全部的新陳代謝。BLyS依賴的細(xì)胞存活需要抗凋亡蛋白Mcl-1的參與。Mcl-1蛋白的水平會隨著BLyS的增加和停藥分別上升和下降，并且Mcl-1基因的條件性缺失會致使BLyS介導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞保護(hù)作用無效。由于BLyS對于所有B淋巴細(xì)胞維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)是必需的，所以這些數(shù)據(jù)提示了一個治療策略，那就是同時抑制mTOR和Pim-2能靶向于病原性B淋巴細(xì)胞而發(fā)揮作用。

2 BLyS參與RA的發(fā)病機(jī)制

RA患者血清中出現(xiàn)自身抗體類風(fēng)濕因子（Rheumatoid factor，RF）使得B淋巴細(xì)胞成為非常明顯的治療靶點。BLyS的過量表達(dá)則可使B淋巴細(xì)胞異常增殖，分泌自身抗體，從而導(dǎo)致一系列自身免疫性疾病的發(fā)生。動物實驗[13]發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因小鼠BLyS過表達(dá)會導(dǎo)致外周B淋巴細(xì)胞的數(shù)量顯著增加，引起脾臟和淋巴結(jié)的腫大，血清中免疫球蛋白M（IgM）、IgG、IgA和IgE水平升高，并出現(xiàn)自身免疫病的癥狀。而阻斷狼瘡小鼠和膠原性關(guān)節(jié)炎（Collogen induced arthritis，CIA）小鼠體內(nèi)的BLyS能夠改善疾病癥狀。此外還發(fā)現(xiàn)BLyS表達(dá)的增加與CIA小鼠疾病的進(jìn)展有關(guān)，在這一動物模型中，脾臟巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞隨著RA的疾病發(fā)展表達(dá)高水平的BLyS[14]。

臨床研究[14，15]發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)性自身免疫性風(fēng)濕病患者，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡（Systemic lupus erythematosus，SLE）和RA，其血清中的BLyS水平與正常人相比是升高的，并且與血清中的IgG水平和自身抗體的水平（包括RF）有關(guān)。RA患者的血清和關(guān)節(jié)滑液中都存在高表達(dá)的BLyS，但關(guān)節(jié)滑液中BLyS的水平高于血清。而且局部炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度與RA患者關(guān)節(jié)腔內(nèi)的BLyS水平呈正相關(guān)，這提示炎性滑膜組織也能產(chǎn)生BLyS。該實驗證明，RA患者的成纖維樣滑膜細(xì)胞（Fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS）能夠表達(dá)BLyS，TNF-α和 IFN-γ的刺激作用能使其表達(dá)上調(diào)。另有研究[16]發(fā)現(xiàn)，早期RA患者血清中的BLyS水平升高，并與自身抗體水平和滑膜炎癥有關(guān)，利用甲氨蝶呤治療后，BLyS水平降低，并伴隨自身抗體滴度的下降和臨床活動度的提高，這提示靶向于BLyS的藥物也可用于早期RA的治療。國外研究[15]顯示，用利妥昔單抗治療RA患者后，其血清中的BLyS水平很高并且在B淋巴細(xì)胞消融治療1～2個月后依然升高。BLyS表達(dá)的增加可能會促進(jìn)B淋巴細(xì)胞再度增殖，并導(dǎo)致RA復(fù)發(fā)。而運用TNF對抗物治療RA，抑制BLyS表達(dá)，降低血漿BLyS蛋白水平，在臨床上取得了不錯的應(yīng)答反應(yīng)[17]。這些證據(jù)都顯示，BLyS在RA的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。

3 以BLyS為作用靶點的治療RA的藥物

3.1 Belimumab

Belimumab（Lymphostat-B）是一種人化的BLyS單克隆抗體，它能夠抑制BLyS的活性，從而降低B淋巴細(xì)胞的增殖和活化。對小鼠的研究[3]發(fā)現(xiàn)，Belimumab可以預(yù)防BLyS誘導(dǎo)的脾臟B淋巴細(xì)胞增殖及降低IgA抗體的滴度。此外，對妊娠短尾猴靜脈注射Belimumab進(jìn)行生殖毒性實驗[3]發(fā)現(xiàn)，該藥物安全性和耐受性良好。Belimumab治療RA患者的Ⅱ期雙盲安慰劑對照試驗[3]結(jié)果表明，將283位RA患者隨機(jī)分為Belimumab 1、4、10 mg·kg－1共3個劑量組和安慰劑對照組（使用安慰劑），所有Belimumab治療組有29%的患者獲得了ACR20（美國風(fēng)濕病學(xué)會20%改善標(biāo)準(zhǔn)）緩解，無明顯量效關(guān)系，而安慰劑組只有16%緩解（ACR20是指臨床研究中觀察的每項指標(biāo)在療程結(jié)束時均需比療程前的基數(shù)改善至少20%，達(dá)到70%則可判斷所研究的藥物為明顯有效，40%～69%為有效，20%～39%為改善，＜20%為無效）。此外，Belimumab治療組RF和Ig水平降低，總B淋巴細(xì)胞減少，但記憶B淋巴細(xì)胞數(shù)量增加，漿細(xì)胞數(shù)量未受影響。Belimumab治療SLE患者的Ⅱ期雙盲安慰劑對照試驗[18]結(jié)果也表明，Belimumab治療用藥能使患者血清中的IgM水平降低，總B淋巴細(xì)胞減少，但對記憶B淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞數(shù)量沒有影響。這些結(jié)果可能是由于BLyS與其系統(tǒng)內(nèi)的其他成員存在信號重疊，或是由于Belimumab未能阻斷BLyS/APRIL異質(zhì)三聯(lián)體。目前Belimumab治療SLE的Ⅲ期臨床試驗正在進(jìn)行中。

3.2 BR3-Fc

BR3-Fc是一種重組融合蛋白，其由二硫鍵連接的2條多肽鏈：人BAFF受體-BR3的胞外區(qū)序列和IgG131的Fc段連接而成?？扇苄缘腂R3-Fc融合蛋白與BLyS結(jié)合，能夠阻斷BLyS與細(xì)胞表面的BR3受體結(jié)合，從而抑制B淋巴細(xì)胞激活導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。動物研究[19]發(fā)現(xiàn)，BR3-Fc能減少短尾猴外周血中的B淋巴細(xì)胞以及淋巴組織中的邊緣區(qū)B淋巴細(xì)胞和濾泡B淋巴細(xì)胞。RA患者的Ⅰ期臨床試驗[19]結(jié)果顯示，BR3-Fc在降低外周血B淋巴細(xì)胞的同時沒有發(fā)生嚴(yán)重的毒性反應(yīng)。該藥物還處于早期研究階段。

3.3 TACI-Ig

TACI-Ig也是一種重組融合蛋白，由TACI受體的胞外部分和IgG1的Fc段連接而成，其能與BLyS、APRIL以及同型三聯(lián)體和異質(zhì)三聯(lián)體結(jié)合，從而抑制B淋巴細(xì)胞激活。TACI-Ig早期的藥名為Atacicept，目前該藥物還處于治療RA、SLE和慢性B型淋巴細(xì)胞性白血?。˙-cell chronic lymphatic leukemia，B-CLL）的臨床研究階段。動物研究[19]發(fā)現(xiàn)，TACI-Ig能使CIA小鼠外周血和淋巴器官中的成熟B淋巴細(xì)胞減少，并使循環(huán)系統(tǒng)中的Ig水平降低。在一項RA患者的Ⅰb期臨床試驗[20]中，將73位患者隨機(jī)分為6個劑量遞增的治療組，1、3、5組單次皮下注射TACI-Ig（70、210、630 mg）或安慰劑，2、4、6組多次皮下注射TACI-Ig（70 mg×3，210 mg×3，420 mg×7）或安慰劑，給藥間隔為2周。給藥后，按照固定的時間間隔采集患者的血液和尿液樣本進(jìn)行檢測。第10周時進(jìn)行藥動學(xué)與藥物安全性的初步評估，并在最后一次給藥后3個月再次評估。結(jié)果顯示，TACI-Ig具有良好的耐受性，能使患者體內(nèi)RF和抗環(huán)瓜氨酸肽抗體（Anti-CCP）水平降低，還能降低血清Ig的水平。單次給藥，約24 h后血漿中TACI-Ig達(dá)到峰濃度，t1/2在25～63 h之間。B淋巴細(xì)胞水平，尤其是記憶B淋巴細(xì)胞數(shù)目，在TACI-Ig治療后下降，但對T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞或單核細(xì)胞沒有影響。該藥物能夠滲入炎癥關(guān)節(jié)發(fā)揮作用，使疾病活動度出現(xiàn)增加的趨勢，并顯示了良好的安全性。研究顯示，采用TACI-Ig治療可以改善RA患者28個關(guān)節(jié)的疾病活動度評分（DAS 28，其是RA患者病情活動的1個綜合評估標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)患者關(guān)節(jié)腫痛數(shù)和實驗室指標(biāo)，客觀評價疾病的活動性，分值越高，說明關(guān)節(jié)炎癥越嚴(yán)重），尤其是給藥420 mg×7次的患者，在治療3個月后，19個患者中有6個達(dá)到ACR20的改善標(biāo)準(zhǔn)。目前，TACI-Ig正處于治療RA的Ⅱ期臨床試驗階段。

4 結(jié)語

B淋巴細(xì)胞通過促進(jìn)免疫復(fù)合物形成、抗原提呈和分泌自身抗體參與RA的發(fā)病，而先前抗B淋巴細(xì)胞抗體利妥昔單抗治療RA的成功事例告訴我們，抑制B淋巴細(xì)胞也許會成為RA的一個新的治療策略。作為B淋巴細(xì)胞的刺激因子，BLyS在調(diào)控機(jī)體免疫應(yīng)答，尤其是體液免疫應(yīng)答中具有重要作用，其參與了RA等自身免疫病的發(fā)病機(jī)制，是具有高度特異性的新靶點。因此，研制BLyS拮抗藥，以特異性抗體或其相關(guān)受體封閉BLyS信號，阻斷BLyS對B、T淋巴細(xì)胞的過度活化，將成為RA等自身免疫病高效且安全的免疫治療方法。

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