依托泊苷固體脂質(zhì)納米粒的研制

于 蓮，趙向男，崔 丹，杜 妍（佳木斯大學藥學院黑龍江省高校生物藥制劑重點實驗室，佳木斯市 154007）

肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，嚴重威脅人類的生命。依托泊苷（Etoposide，ET）為鬼臼毒素的糖代謝產(chǎn)物，具有廣譜抗癌活性，尤其對早期擴散、預后惡劣的小細胞肺癌效果良好。改變劑型、提高已有抗癌藥的療效、降低其毒副作用，已成當務之急。固體脂質(zhì)納米粒（Solid lipid nanoparticles，SLN）的研究起始于20世紀90年代，是新型的亞微給藥系統(tǒng)，其不但可以促進藥物吸收、減少藥物毒性，而且還有控釋、靶向的功能[1]。本試驗將ET制成SLN，以期通過緩釋作用提高藥物的療效。

1 儀器與試藥

JY92-2D型超聲波細胞破碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；JB-2型恒溫磁力攪拌器（上海雷磁儀器廠）；Zetasizer 3000 HS納米粒度及表面電位分析儀（英國Malvern公司）；JEM-1200Ex透射電鏡（日本電子公司）；1100型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；LE-80K型超高速冷凍離心機（美國Beckman公司）。

ET原料藥及對照品（淄博磐信醫(yī)藥化工有限公司，批號：PX20091105，含量：99.4%）；ET-SLN（佳木斯大學藥學院自制，批號：20100315，含量：12.4%）；單硬脂酸甘油酯（天津市博迪化工有限公司）；大豆磷脂（上海金伴藥業(yè)有限公司）；泊洛沙姆（型號：188，德國BASF公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 ET-SLN制備

采用乳化-超聲分散法制備。稱取處方量單硬脂酸甘油酯（脂質(zhì)材料）與ET混勻，加熱70℃熔融，作為油相。將大豆磷脂、泊洛沙姆作為復配乳化劑加入10 mL重蒸餾水溶解，迅速加熱至相同溫度作為水相。在磁力攪拌下將油相滴加到同溫度水相中制備成初乳[2]，繼續(xù)攪拌同時加入冷水（4℃）至20 mL。超聲波細胞破碎機600 W超聲10 min，冷卻至室溫，得ET-SLN分散液，用0.45μm微孔濾膜過濾得ET-SLN膠體分散液，同法制備不含藥物的SLN分散液，作為空白對照。

2.2 正交試驗篩選ET-SLN最優(yōu)處方

通過前期單因素考察結(jié)果得知，脂質(zhì)材料和乳化劑的用量對ET-SLN的包封率有較大的影響。分別以單硬脂酸甘油酯、大豆磷脂、泊洛沙姆、ET的處方用量為A、B、C、D 4個因素，每個因素設3個水平，采用L9（34）正交設計表，以包封率（EE/%，包封率＝（c總投藥量－c上清液）/c總投藥量×100%）為評價指標進行正交試驗，結(jié)果見表1、表2、表3。

表1 因素水平表Tab 1 Factors and levels

Rj的值越大，說明該因素影響越明顯；由此可知，各因素影響的主次順序是B＞A＞D＞C，由表2得出的最優(yōu)化處方為第8號處方，即A3B2C1D3，單硬脂酸甘油酯、大豆磷脂、泊洛沙姆、ET的處方用量分別為0.020、0.010、0.015、0.015 mg，該處方制得ET-SLN包封率較高，選取最優(yōu)處方按“2.1”項下方法制備3批，計算包封率結(jié)果見表4。

表2 正交試驗結(jié)果Tab 2 Results of orthogonal test

表3 方差分析結(jié)果Tab 3 Variance analysis

表4 3批ET-SLN包封率測定結(jié)果Tab 4 Encapsulate coefficiency of 3 batches of ET-SLN

2.3 ET-SLN形態(tài)、粒徑、表面電位的測定

納米粒體系用水稀釋20倍，吸取2滴，用2%磷鎢酸鈉負染，以透射電鏡觀察其形態(tài)及分布，結(jié)果見圖1；以激光粒度分析儀測定粒徑和粒度分布，結(jié)果見圖2。

圖1 ET-SLN透射電鏡圖（×105）Fig 1 TEM of ET-SLN（×105）

圖2 ET-SLN粒徑分布Fig 2 Distribution of particle size of ET-SLN

由圖1可見，制得的ET-SLN形態(tài)較圓整，大小較均一，基本為類球形的實體粒子。ET-SLN平均粒徑（83±0.5）nm、粒度分布窄。

以表面電位分析儀測定Zeta電位，結(jié)果為（－23±0.3）mV，屬熱力學穩(wěn)定體系[3]。本研究制得的納米粒表面帶有負電荷，可以與帶正電荷的藥物作用，從而得到高包封率的載藥納米粒。

2.4 包封率和載藥量的測定

2.4.1 含量測定

（1）色譜條件：色譜柱為Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-水-乙腈＝30∶50 ∶20；檢測波長為285 nm；流速為0.7 mL·min－1；柱溫為30 ℃；進樣量為20 μL。

（2）溶液制備及系統(tǒng)適用性試驗：對照品溶液：精密量取ET對照品貯備液（500 μg·mL－1）1 mL置于10 mL容量瓶中，用流動相稀釋，定容，制得50 μg·mL－1的對照品溶液進樣。供試品溶液和空白溶液：精密量取ET-SLN或空白SLN 0.5 mL置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容；精密量取上述溶液1 mL置于10 mL容量瓶中，加流動相定容即得。進樣后，3種溶液色譜結(jié)果見圖3。

圖3 高效液相色譜圖Fig 3 HPLC chromatograms

（3）線性范圍及方法學考察：精密稱取ET對照品適量，用流動相溶解并稀釋成濃度為50 μg·mL－1溶液。分別精密量取上述溶液2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL置于10 mL容量瓶中，流動相定容后進樣。以峰面積（A）對濃度（c，mg·mL－1）作圖，繪制標準曲線，得回歸方程A＝41.368c+383.06（r＝0.999 3），ET檢測濃度線性范圍為0.01～0.035 mg·mL－1；平均回收率為98.8%（RSD為0.77%，n＝9）；精密度試驗中RSD為0.67%（n＝6）。

2.4.2 包封率和載藥量測定方法

采用低溫超速離心法。精密移取納米粒1 mL，然后超速離心（30 000 r·min－1）30 min，上清液稀釋后用高效液相色譜法測定，計算藥物包封率和載藥量（載藥量＝（c總投藥量－c上清液）/c納米?！?00%）。結(jié)果，3批ET-SLN包封率平均為81.2%，平均載藥量為12.4%。

2.5 體外釋放試驗

采用動態(tài)透析袋法考察體外釋放情況，根據(jù)《中國藥典》2010年版二部附錄釋放度測定法[4]進行。ET在37℃時，其在磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.4）中飽和溶解度僅為145～150 mg·L－1。移取2 mL的ET-SLN分散液置于截留分子量為14 000的透析袋中，兩端夾緊，置于裝有PBS 50 mL的錐形瓶中，在（37±0.5）℃恒溫水浴振蕩器中，分別于0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、48 h將介質(zhì)全部取出（同時補加50 mL空白釋放介質(zhì)），過0.22 μm微孔濾膜，測定藥物含量，計算累積釋藥率，繪制體外釋藥曲線，詳見圖4。

圖4 ET-SLN體外釋藥曲線Fig 4 Drug release profile of ET-SLN

由圖4可知，ET-SLN在最初的2 h，釋放了藥物總量的40%左右；隨后，結(jié)合在脂質(zhì)納米粒骨架中的藥物呈相對緩慢的速度釋放，可持續(xù)48 h。

3 討論

采用乳化-超聲分散法制備ET-SLN操作簡單、易于控制，儀器價格低廉、成本低，比較適合實驗室操作。

以生理相容的、可生物降解的單硬脂酸甘油酯作為脂質(zhì)材料制備的SLN的粒徑較小且分布均勻；以大豆磷脂和泊洛沙姆（188）作復合乳化劑時，可以提高SLN表面的親水性、增大空間位阻及調(diào)整電位，延長SLN在體內(nèi)的循環(huán)時間，不但能夠有效地降低粒徑，而且制得的納米粒穩(wěn)定性較好。

體外釋藥時，在2 h內(nèi)，藥物分子可能一部分吸附在納米粒的表面，或者富集在納米粒的外層而產(chǎn)生突釋，此后藥物的釋放主要是從固體骨架中擴散，并達到緩釋作用。

[1] 翟 文，陳慶華，朱寶泉.固體脂質(zhì)納米粒的研究進展[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2001，32（9）：424.

[2] 耿葉慧，楊 麗，張 瑜，等.吡喹酮固體脂質(zhì)納米粒的制備及其理化性質(zhì)研究[J].中國藥房，2007，18（28）：2 197.

[3] 曹露曄，閆晶超，王玉生，等.藍萼甲素固體脂質(zhì)納米粒的制備及理化性質(zhì)研究[J].中國藥房，2008，19（9）：666.

[4] 國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（二部）[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄ⅩD.