弓形蟲微線體蛋白MIC3的研究進(jìn)展＊

江 濤

弓形蟲（Toxoplasmagondii）的微線體（microneme）散布于蟲體前端棒狀體周圍，是一種具有分泌功能的細(xì)胞器，其分泌的微線體蛋白（microneme proteins MICs）與蟲體對(duì)宿主細(xì)胞的識(shí)別和結(jié)合密切相關(guān)，在蟲體入侵宿主細(xì)胞早期發(fā)揮重要作用［1］。目前發(fā)現(xiàn)的微線體蛋白有15種以上，包括 MIC1－MIC12、AMA1、SUB1、SUB2等［2］，MIC3是其中重要的一種微線體蛋白。由于MIC3在弓形蟲的速殖子、緩殖子和子孢子期都能表達(dá)，被認(rèn)為是在弓形蟲病的診斷和疫苗研制上非常有前景的候選分子［3－4］。

1 MIC3的結(jié)構(gòu)

MIC3于1991年發(fā)現(xiàn)，Achbarou等［5］研究表明MIC3分子量約為90 k D，由2個(gè)38 k D的多肽組成，其等電點(diǎn)分別為6.75和6.70，均可被相同的單克隆抗體識(shí)別，認(rèn)為2條多肽鏈?zhǔn)峭吹?，且通過二硫橋連接在一起。Garcia－Reguet等［6］首次對(duì)MIC3基因的堿基序列進(jìn)行了鑒定分析，發(fā)現(xiàn)MIC3基因是單拷貝基因，不含內(nèi)含子，ORF編碼395個(gè)氨基酸殘基的多肽，MIC3含有34個(gè)半胱氨酸，等電點(diǎn)為5.98，推導(dǎo)有12個(gè)磷酸化位點(diǎn)，1個(gè)潛在的N－糖基化氨基酸共有序列Asn－X－Ser/Thr位于肽鏈的201處，MIC3蛋白序列含有5個(gè)表皮生長(zhǎng)因子樣（epidermal growth factor－like，EGF）結(jié)構(gòu)域和1個(gè)氨基端的類幾丁質(zhì)（chitin binding－like，CBL）模體。EGF1～EGF5分別位于aa118～159、147～189、190～236、237～290和263～343，其中EGF2－3串聯(lián)排列，EGF1和EGF5分別與EGF2和EGF4部分重疊；CBL模體中含有8個(gè)能夠形成二硫鍵的半胱氨酸和3個(gè)高度保守的芳香族殘基。MIC3蛋白N端有一個(gè)26個(gè)氨基酸的疏水信號(hào)肽，無跨膜區(qū)域，應(yīng)用Edman降解法對(duì)N－末端微序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，40個(gè)氨基酸的前肽序列位于信號(hào)肽序列切割點(diǎn)下游，顯示MIC3在其生物合成期間必須進(jìn)行加工處理，推導(dǎo)切除前肽和信號(hào)肽后的預(yù)測(cè)分子量與MIC3一個(gè)成熟亞單位的表觀分子量（38 k D）非常吻合。Cérède等［3］進(jìn)一步研究分析發(fā)現(xiàn)弓形蟲速殖子體內(nèi)的MIC3是一種90 k D的蛋白質(zhì)。在分泌轉(zhuǎn)運(yùn)途徑中及貯存前合成的是40 k D蛋白質(zhì)前體，經(jīng)蛋白酶水解成為38 k D終產(chǎn)物，并折疊成90 k D二聚體。將編碼全長(zhǎng)MIC3的核苷酸序列克隆入哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pcDNA3，然后轉(zhuǎn)染BHK－21細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，用 Western－blot分析轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解物，發(fā)現(xiàn)在未還原條件下重組MIC3是100 k D二聚體，在還原條件下是42 k D單體，與弓形蟲中分離提純的天然MIC3二聚體（90 k D）和單體（38 k D）存在差異。認(rèn)為切割MIC3前體的蛋白水解酶是弓形蟲所特有，哺乳動(dòng)物細(xì)胞中缺乏該酶，不能對(duì)MIC3進(jìn)行前體肽的降解，但可折疊成二聚體（100 k D）。雖然哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的重組MIC3二聚體或單體不能有效地與宿主細(xì)胞表面結(jié)合，但仍然保留其與相應(yīng)抗體發(fā)生特異性結(jié)合的性質(zhì)。2條38 k D多肽還可通過蛋白質(zhì)間的相互作用連接形成成熟的90 k D二聚體。Ismael等［4］的研究也得出了同樣的結(jié)論。

江濤等［7］采用分子生物信息學(xué)軟件對(duì)全長(zhǎng)的MIC3的二級(jí)結(jié)構(gòu)和B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)。發(fā)現(xiàn)該蛋白結(jié)構(gòu)中含有較多的α－螺旋區(qū)段，主要集中分布于蛋白質(zhì)的兩端；非常豐富的β－轉(zhuǎn)角，比較集中地分布在蛋白質(zhì)的中間區(qū)域；較多的無規(guī)則卷曲，其結(jié)構(gòu)比較松散、突出，易于形變，多位于蛋白質(zhì)分子表面。MIC3的B細(xì)胞抗原表位的優(yōu)勢(shì)區(qū)域位于N端第83～94、136～141和240～243區(qū)段內(nèi)或其附近。

2 MIC3的功能

Cérède［3］通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn)觀察到，Vero細(xì)胞能與天然的MIC3強(qiáng)烈結(jié)合，但不能與重組MIC3（r MIC3）反應(yīng)，認(rèn)為裂解 MIC3前肽的蛋白酶是弓形蟲特有，前肽序列的存在阻礙了這種結(jié)合（粘附），但并不妨礙二聚體的形成。信號(hào)肽能引導(dǎo)MIC3的正確分泌、轉(zhuǎn)運(yùn)與定位，而切除信號(hào)肽的重組MIC3也能結(jié)合到宿主細(xì)胞的表面，共聚焦技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)MIC3能通過直接與宿主細(xì)胞表面受體結(jié)合而發(fā)揮作用。還發(fā)現(xiàn)EGF樣結(jié)構(gòu)域不參與MIC3對(duì)宿主細(xì)胞受體的識(shí)別，或者單獨(dú)的EGF樣結(jié)構(gòu)域不能提高M(jìn)IC3對(duì)宿主細(xì)胞的粘附力，但有助于正確呈現(xiàn)粘附模體的結(jié)構(gòu)，可能在其構(gòu)象形成中發(fā)揮作用，并且EGF樣結(jié)構(gòu)域還參與MIC3和其陪護(hù)伴侶MIC8形成MIC3－MIC8復(fù)合體。CBL序列是弓形蟲的粘附模體，二聚體的形成是CBL模體發(fā)揮作用的重要因素。CBL結(jié)構(gòu)域含有的半胱氨酸和高度保守的芳香族殘基，可以保證蛋白結(jié)構(gòu)的正確折疊和與宿主細(xì)胞膜上N－乙酰葡萄糖胺的結(jié)合。

Cérède等［8］進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，將 MIC3的 CBL結(jié)構(gòu)域上的126位色氨酸替換成甘氨酸、128位苯丙氨酸替換成甘氨酸的突變株對(duì)小鼠的侵染能力明顯下降，攻蟲感染40 d后的小鼠存活率分別為83.3%和95% 。表明MIC3上的CBL結(jié)構(gòu)域與弓形蟲侵染細(xì)胞能力有密切關(guān)系。

3 MIC3的應(yīng)用

3.1 在疫苗上的應(yīng)用 Ismael等［4］用編碼不成熟MIC3的質(zhì)粒p MIC3i肌肉免疫接種CBA/J小鼠，結(jié)果全部小鼠血清中抗p MIC3i特異性抗體IgG滴度很 高，出 現(xiàn) 大 量 的 IFN－γ 及 IL－2、IgG2a 和IgG2b，說明p MIC3i能激發(fā)強(qiáng)烈的體液免疫和細(xì)胞免疫；用編碼粒細(xì)胞－巨噬細(xì)胞集落刺激因子基因的質(zhì)粒p GM－CSF與質(zhì)粒p MICi3聯(lián)合免疫接種小鼠后，能產(chǎn)生更顯著的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答；小鼠經(jīng)3次免疫后，口服弓形蟲76 K株包囊，1月后經(jīng)檢測(cè)其大腦內(nèi)的包囊數(shù)量明顯少于對(duì)照組小鼠，且聯(lián)合免疫接種對(duì)小鼠能起到更好的保護(hù)作用。

Ismael等［9］將弓形蟲RH株的 MIC1和 MIC3基因敲除，構(gòu)建 MIC1－3KO突變株，腹腔注射小鼠（20個(gè)速殖子/只），能激發(fā)強(qiáng)烈的體液免疫和Th1型細(xì)胞免疫，血清中IFN－γ、IL－2、IL－10的滴度明顯增加；71 d后以蟲株76 K卵囊45個(gè)口服感染免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠大腦組織中弓形蟲包囊數(shù)比對(duì)照組減少96%以上。Mévélec［10］以105個(gè) MIC1－3KO 株速殖子皮下接種3組母羊，只出現(xiàn)輕度的發(fā)熱反應(yīng)。免疫母羊1月后配種，在妊娠中期口服弓形蟲PRV株卵囊（1、2組分別400個(gè)，3組100個(gè)），同時(shí)設(shè)未免疫對(duì)照組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組母羊只出現(xiàn)輕微體溫升高，所產(chǎn)羔羊未見弓形蟲感染的臨床癥狀，3組羔羊的存活率分別為62%、91%和64%。說明MIC1－3KO蟲株與S48蟲株有相同的免疫效果，認(rèn)為MIC1－3KO蟲株是具有開發(fā)應(yīng)用潛力的疫苗。

江濤等［11］構(gòu)建了弓形蟲RH株 MIC3基因的原核表達(dá)質(zhì)粒載體p GEX－KG－MIC3，其表達(dá)產(chǎn)物r MIC3主要以包涵體形式存在，Western－blot試驗(yàn)可被兔抗弓形蟲免疫血清識(shí)別，顯示有良好的反應(yīng)原性。以純化、復(fù)性的r MIC3混合免疫佐劑皮下注射Balb/c小鼠，6 w血清特異抗體滴度和攻蟲后小鼠的平均存活時(shí)間與對(duì)照組比較有明顯提高［12］。構(gòu)建MIC3基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pc MIC3轉(zhuǎn)染IBRS－2細(xì)胞后，其表達(dá)的蛋白質(zhì)具有良好的免疫活性［13］；再將質(zhì)粒pc MIC3以肌肉注射的方式間隔2 w 3次免疫Balb/c小鼠，同時(shí)設(shè)空載體pc DNA3.1和PBS對(duì)照。在首免后第8 w分別以MTT比色法和CTL法測(cè)定小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖應(yīng)答和細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）毒活性。與對(duì)照組相比，免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞和CTL毒活性均極顯著增強(qiáng)（P＜0.01）。表明pc MIC3質(zhì)粒免疫的小鼠能誘導(dǎo)強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫反應(yīng)和體液免疫反應(yīng)。在免疫8 w后以弓形蟲RH強(qiáng)毒株攻擊，第45 d的平均生存率達(dá)78%，而對(duì)照組在7.5～9 d時(shí)全部死亡［14］。

張燕麗等［15］構(gòu)建了弓形蟲GJS株MIC3基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA－MIC3，轉(zhuǎn)染BHK－21細(xì)胞后，表達(dá)產(chǎn)物可被羊抗弓形蟲超免血清識(shí)別，具有良好的抗原性；pcDNA－MIC3質(zhì)粒肌肉注射Balb/c小鼠，血清中出現(xiàn)高滴度的特異抗體，對(duì)GJS蟲株的攻擊產(chǎn)生較強(qiáng)抵抗力。

Fang等［16－17］構(gòu) 建 了 弓 形蟲 RH 株 MIC3 基 因的自殺性重組質(zhì)粒載體pSCA/MIC3和重組桿狀病毒疫苗 Ac－V－MIC3，能高效轉(zhuǎn)染（導(dǎo)）哺乳動(dòng)物BHK－21細(xì)胞和PK－15細(xì)胞，并進(jìn)行有效表達(dá)；分別免疫Balb/c小鼠，均能產(chǎn)生強(qiáng)烈的體液免疫和細(xì)胞免疫，并有效抵抗致死性蟲株的攻擊。

3.2 在 診 斷 上 的 應(yīng) 用 江 濤 等［18－19］以 純 化 的r MIC3作為抗原建立了乳膠凝集試驗(yàn)（LAT）和ELISA等2種弓形蟲病診斷方法，檢測(cè)人工試驗(yàn)感染弓形蟲豬，發(fā)現(xiàn)分別在感染的4～57 d、14～57 d可查到血清中特異性抗體，且分別在8～45 d、18～45 d的檢測(cè)陽(yáng)性率達(dá)100%（8/8），2種方法檢測(cè)衣原體、胸膜肺炎放線桿菌、口蹄疫病毒、豬瘟病毒、旋毛蟲、圓環(huán)病毒、副豬嗜血桿菌、偽狂犬病病毒及附紅細(xì)胞體陽(yáng)性血清均為陰性，具有特異性高、反應(yīng)靈敏、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，優(yōu)于以蟲體天然成分為抗原建立的IHA。張東林等［20－21］以r MIC3為抗原建立SPA－ELISA和AG－ELISA，檢測(cè)豬、山羊等動(dòng)物弓形蟲感染，操作簡(jiǎn)便、快速，效果良好。張?jiān)丛吹龋?2］以原核表達(dá)的r Tg MIC3為抗原建立ELISA，用于檢測(cè)22只實(shí)驗(yàn)感染弓形蟲ME49株7 d后的小鼠血清抗體，陽(yáng)性率為100%，而12只實(shí)驗(yàn)感染牛新孢子蟲的小鼠血清均為陰性，表明以r Tg MIC3為包被抗原的ELISA檢測(cè)弓形蟲抗體具有較高的敏感性和特異性。

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