副結核病診斷抗原研究進展＊

徐鳳宇，姜秀云，么乃全，錢愛東

2.吉林農業(yè)大學動物生產及產品質量安全教育部重點實驗室，長春 130118；

3.吉林農業(yè)大學生命科學學院，長春 130118

副結核病是由禽分枝桿菌副結核亞種（Mycobacteriumaviumsubsp.Paratuberculosis，MAP）引起的多種動物共患的慢性、腸道肉芽腫性傳染病，也稱Johne＇s病，呈世界性分布，在我國被列入二類動物疫病。調查表明，美國大約20%～40%的奶牛群感染MAP，常導致產奶量下降及體重減輕，每頭感染牛每年的損失約＄227［1］。由于目前針對該病的疫苗存在干擾檢疫等缺點，所以根除的最好辦法是盡早檢出、隔離或淘汰病畜。該病原的檢測方法有多種，如直接鏡檢、分離培養(yǎng)、分子生物學檢測、噬菌體生物擴增技術等［2］，但這些方法或敏感性不高，或耗時長，且在疾病的亞臨床階段揭發(fā)率較低，而恰恰該病的亞臨床期較長，所以降低了以上方法在臨床診斷中的應用價值。血清學方法和遲發(fā)型過敏反應可快速、有效地診斷該病，有些方法能檢出亞臨床病例［3］，但目前這些以抗原為基礎的檢測方法所用抗原多為復合物，與其它分枝桿菌存在交叉反應，而環(huán)境中的腐生分枝桿菌等又常侵襲動物，所以使用復合抗原檢測的特異性不高，限制了其在臨床檢測中的應用。所以，近年很多研究與優(yōu)化診斷抗原相關，隨著該病原基因組全序列的揭曉，這項工作的進程也在加快，特綜述之。

1 復合抗原

為提高副結核病診斷的特異性，有學者對MAP的蛋白組分進行了研究。Cho等［4］比較了該菌產生的培養(yǎng)濾液（culture filtrates，CF）和細胞提取液（cellular extracts，CE）的蛋白質組，研究了二者的抗原性，發(fā)現(xiàn)CE蛋白分子量范圍較寬，有的蛋白達100 ku，而多數(shù)CF蛋白分子量小于50 ku；二維電泳結果表明：CF蛋白的等電點（pI值）很窄，多為p H 4.0～5.5，CE蛋白的pI值為p H 4.0～7.0；用MAP自然感染的牛血清進行免疫印跡分析，與血清發(fā)生反應的CF蛋白較多，暗示進行血清學檢測時，可用CF代替CE；但即使是以CF蛋白為抗原，也不能檢測所有的MAP陽性牛，尤其是在感染早期未產生足夠的抗體應答時。在此基礎上，該課題組以MAP JTC303株CF蛋白為抗原，將待檢牛血清、牛奶用草分枝桿菌的細胞提取物吸收去除其中的交叉抗體，建立了JTC－ELISA方法，與5個商業(yè)ELISA試劑盒相比，診斷的敏感性明顯提高，特異性也很穩(wěn)定，尤其在糞排菌率較低的病例中應用效果更好，敏感性為40%，而商業(yè)試劑盒的敏感性為20%［5］。我國何昭陽等［6］采用除去草分枝桿菌抗原或其類屬抗原的辦法，制備了親和層析抗原和草柱親和抗原，建立的ELISA檢測方法表現(xiàn)出了良好的特異性，其中草柱親和抗原制備更容易，收獲量多，有利于大批量生產應用，將其應用于臨床中效果非常好，尤其適用于消除PPD－ELISA產生的假陽性反應。

2 特異抗原

2.1 細胞免疫診斷抗原

2.1.1 Ag85復合物 作為分枝酰轉移酶家族，Ag85復合物存在于MAP培養(yǎng)濾液中，大小約30～32 ku。一方面，它是MAP、牛分枝桿菌、結核分枝桿菌等的保護性抗原，亞單位疫苗的候選抗原之一；另一方面，它能有效增強MAP感染10周左右的牛產生體外IFN－γ應答，其中Ag85A（MAP 0216）和Ag85B（MAP 1609c）合成肽作用強于Ag85C（MAP 3531c）；用實驗感染牛鑒定發(fā)現(xiàn)，Ag85B的T細胞表位在第145～162個氨基酸之間；應用重組并純化的Ag85A和Ag85B檢測感染MAP的犢牛會產生增殖反應，作為T細胞抗原可以早期識別自然感染牛［7］。

2.1.2 MAP1204和 MAP1087 Bannantine等［1］分析了92個重組的MAP蛋白（包括Ag85復合物），發(fā)現(xiàn)有兩個可能的抗原很適合作為副結核病牛的早期（感染后70天）檢測，這兩個蛋白分別由MAP1087和MAP1204編碼，大小分別為146、244個氨基酸，且兩個蛋白聯(lián)合應用能檢測出更多的亞臨床病牛，為該病的早期診斷提供了思路。

2.1.3 MAP41 2005 年，Nagata 等［8］獲 得 了MAP10、MAP39和MAP41（后兩者為PPE家族成員，分別由MAP3184、MAP1518基因編碼）的核苷酸序列，并用大腸桿菌表達了此三種蛋白，發(fā)現(xiàn)它們能增強MAP感染牛外周血單核細胞產生IFN－γ的能力。一般而言，感染MAP的牛血細胞在用MAP抗原刺激后會產生大量IL－10，從而抑制T細胞產生IFN－γ，可以作為重要的診斷指標。2010年，該研究者［9］發(fā)現(xiàn)MAP41可誘導接種MAP兩周后的實驗牛產生IL－10，檢出的時間早于IFN－γ，產生的量高于其他分枝桿菌感染的牛，在以豚鼠為實驗動物時也得到了相似的結果。此研究表明，MAP41檢測IL－10水平可以作為一種有效的檢測方法，而且能提前檢出時間，減少帶菌動物排菌污染環(huán)境并對其他動物及人類造成的威脅，有利于更好地控制副結核病。

2.2 體液免疫診斷抗原

2.2.1 34 ku蛋白 34 ku蛋白的編碼基因是從MAP的λgt11文庫中篩選到的，該基因包含三部分。最初的研究表明，其編碼的13.6 ku羧基端（a362）與所有檢測的MAP發(fā)生反應而不與其它20株菌包括禽分枝亞種禽亞種（MAA）和胞內分枝桿菌發(fā)生反應。免疫電鏡觀察發(fā)現(xiàn)在MAP表面存在a362多肽，用重組的a362多肽作ELISA抗原，結果能對所有檢測的感染牛及疾病所有階段的血樣準確分析，認為該蛋白的羧基端含有種特異性表位，曾被用于牛副結核病的ELISA特異性診斷中。但是，2007年 Malamo等［10］制備了a362的單克隆抗體（MAbs），在ELISA和免疫印跡實驗中，2株單抗均與MAA、胞內分枝桿菌發(fā)生交叉反應，重組蛋白也與3種分枝桿菌的兔多克隆抗體發(fā)生反應，表明該蛋白羧基端有MAP、MAA及胞內分枝桿菌共有的抗原決定簇，在自然感染牛體內很容易誘導抗體產生，共有決定簇降低了34 ku蛋白的羧基端用于診斷的特異性。

另外，Willemsen等［11］發(fā)現(xiàn)9、15和34 ku蛋白（分別由MAP2609、MAP2942c和MAP0210c編碼）與結核桿菌的TB8.4、MPT53和Erp抗原具有很高的同源性，且都能被臨床或亞臨床感染牛的抗體識別，三者均為分泌抗原，可能被用作診斷抗原。經過氨基酸序列比較，此處的34 ku蛋白與前述的34 ku并非同一物質。

2.2.2 35 ku抗原 Zaatari等［12］克隆并表達了分子量35 ku的抗原（p35 Ag），發(fā)現(xiàn)編碼此蛋白的基因（p35）只與禽分枝桿菌復合群的DNA雜交。用感染或未感染的57只動物參考血清進行免疫印跡，發(fā)現(xiàn)它能100%識別處于臨床期動物（12頭牛、2只山羊和2只綿羊）的血清，對處于亞臨床階段的20頭牛的血清識別率為75%，而15頭非MAP感染奶牛、3頭BCG接種的牛、3頭人工大劑量接種MAP的奶牛血清不能被p35 Ag識別?？偟拿舾行?、特異性、陽性預測值、陰性預測值分別為86%、100%、100%和75%，p35 Ag免疫印跡的準確率超過了當時商業(yè)上可用的診斷Johne＇s病的方法，推測其可用于副結核病的診斷，其編碼基因可作成探針等用于禽分枝桿菌復合群診斷。

2.2.3 MAP0862 等 Paustian 等［13］通 過 分 析MAP的基因組，鑒定了13個ORF。純化其中的5種蛋白，用其與自然感染的牛、暴露于MAP的鼠和兔的血清進行免疫印跡分析，發(fā)現(xiàn)其中MAP0862、MAP3732c和MAP2963c幾乎可以被所有的病牛血清識別；進一步分析MAP0862，發(fā)現(xiàn)其只與感染牛血清發(fā)生反應，初步確定了其在診斷中的意義。Bannantine等［14］在改進檢測羊副結核病的ELISA研究中發(fā)現(xiàn)，用重組蛋白MAP0862和MAP3786做抗原時產生的免疫反應較強，MAP0862能檢出81%的 MAP感染羊。國內遲磊等［15］擴增了MAP0862和MAP2154c，并進行誘導融合表達，得到了76 ku的重組蛋白MAP0862/2154c，為其在診斷中的應用奠定了基礎。

2.2.4 MAP0865和 MAP1637c Leroy等［16］應用生物信息學工具，從MAP的基因組中篩選出87個MAP特有的序列，通過抗原性分析選擇3個具有免疫原性的基因，應用重組純化抗原建立的ELISA檢測方法表明，有兩個抗原特異性高于商品化的試劑盒，達到98%（后者為92%），敏感性達分別為72%和82%，前者與 MAP0865有關，被作者命名為Ag6，后者為MAP1637c。生物信息學方法的應用為尋找侯選抗原提供了思路。

2.2.5 MAP1272c和 MAP2121c等 Li等［17］等用重組表達的MAP1272c和MAP2121c作為抗原，建立了ELISA方法，對7份陽性血清進行檢測，發(fā)現(xiàn)前者能檢出7份，后者為能檢出5份，顯示了MAP1272c在血清學診斷方面的潛在價值。Bannantine等［18］（2008年）對43個 MAP重組蛋白進行了研究，表明除 MAP3155c能與Johne＇s病牛血清發(fā)生強烈的免疫反應外，Dna K（Hsp70）、MAP2121c能被免疫的鼠和兔血清識別。

Bannantine等［19］建立了檢測血清中MAP抗體的蛋白微陣列，93個重組蛋白被點到硝酸纖維素上，采用健康、牛分枝桿菌感染、MAA感染牛血清鑒定這些蛋白的非特異性，結果表明與MAA感染牛血清交叉反應更強；后又應用自然或實驗感染牛血清識別這些抗原，結果檢測到3個膜蛋白與Johne＇s牛血清發(fā)生最強烈的反應，它們是侵襲蛋白、ABC肽運輸透明質酸酶和假定的鳥苷三磷酸蛋白。

［1］Bannantine J P，Bayles DO，Waters W R，et al.Early antibody response againstMycobacteriumaviumsubspeciesparatuberculosisantigen in subclinical cattle［J］.Proteome Sci，2008，28：（6）：5.

［2］徐鳳宇，姜秀云，么乃全，等.禽分枝桿菌副結核亞種檢測方法研究進展［J］.中國預防獸醫(yī)學報，2010，32，（4）：325－328.

［3］WHO.哺乳動物、禽、蜜蜂A和B類疾病診斷試驗和疫苗標準手冊［M］.北京：中國農業(yè)科學技術出版社，2002：273－284.

［4］Donghee Cho，Michael T.Collins.et al.Comparison of the Proteosomes and Antigenicities of Secreted and Cellular Proteins Produced byMycobacteriumparatuberculosis［J］.Clinical and Vaccine Immunology，2006，13（10）：1155－1161.

［5］Sung J S，Donghee C，Michael T.Collins.Diagnosis of Bovine Paratuberculosis by a Novel Enzyme－Linked Immunosorbent Assay Based on Early Secreted Antigens ofMycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosis［J］.Clinical and Vaccine Immunology，2008，15（8）：1277－1281.

［6］何昭陽，顧萬鈞，錢愛東等.副結核ELISA中兩種親和抗原的比較［J］.中國畜禽傳染病，1990，51（2）：31－32.

［7］Valérie Rosseels，Sylvie Marché，Virginie Roupie，et al.Members of the 30－to 32－Kilodalton Mycolyl Transferase Family（Ag85）from Culture Filtrate ofMycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosisAre Immunodominant Th1－Type Antigens Recognized Early upon Infection in Mice and Cattle［J］.Infection and Immunity，2006，74（1）：202－212.

［8］Reiko N，Yoshihiro M，Kazuhiro Y，et al.Expression Cloning of Gamma Interferon－Inducing Antigens ofMycobacteriumaviumsubsp.Paratuberculosis［J］.Infection and Immunity，2005，73（6）：3778－3782.

［9］Reiko N，Satoko K，Yuu M，et al.A specific induction of interleukin－10 by the Map41 recombinant PPE antigen of Mycobacterium avium subsp.paratuberculos［J］.Veterinary Immunology and Immunopathology，2010，135（1－2）：71－78.

［10］Malamo M，Okazaki K，Sakoda Y，et al.Carboxyl terminus of the 34 kDa protein ofMycobacteriumparatuberculosisshares homologous B－cell epitopes withMycobacteriumaviumand Mycobacteriumintracellulare［J］.The Veterinary Record，2007，161：853－857.

［11］Peter T J.Willemsen，Jos Westerveen，Annemieke Dinkla，et al.Secreted antigens ofMycobacteriumaviumsubspeciesparatuberculosisas prominent immune targets［J］.2006，114（3－4）：337－344.

［12］FA El－Zaatari，SA Naser，DY Graham.Characterization of a

specificMycobacteriumparatuberculosisrecombinant clone expressing 35，000－molecular－weight antigen and reactivity with sera from animals with clinical and subclinical Johne＇s disease［J］.Journal of Clinical Microbiology，1997，35（7）：1794－1799.［13］Michael L P，Alongkorn A，Vivek K，et al.Characterization of Novel Coding Sequences Specific toMycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosis：Implications for Diagnosis of Johne＇s Disease［J］.Journal of Clinical Microbiology，2004，42（6）：2675－2681.

［14］John P B，Valentina Rosu，Stefania Zanetti，et al.Antigenic profiles of recombinant proteins fromMycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosisin sheep with John/s disease［J］.Veterinary Immunology and Immunopathology［J］.2008，122（1－2）：116－125.

［15］遲磊，劉思國，王春來，等.禽分枝桿菌副結核亞種map0862基因與map2154c基因的串聯(lián)重組表達［J］.中國獸醫(yī)科學，2008，38（10）：856－859.

［16］B.Leroy，S.Viart，N.Trinchero.et al.Use ofMycobacterium aviumsubsp.paratuberculosisspecific coding sequences for serodiagnosis of bovine paratuberculosis［J］.Veterinary Microbiology，2009，135：313－319.

［17］Lingling Li，Shirin Munir，John P.Bannantine，et al.Rapid Expression ofMycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosisRecombinant Proteins for Antigen Discovery［J］.Clinical and Vaccine Immunology，2007，14（1）：102－105.

［18］Bannantine JP，Waters WR，Stabel JR，et al.Development and use of a partialMycobacteriumaviumsubspeciesparatuberculosisprotein array［J］.Proteomics.2008，8（3）：463－474.

［19］John P B，Michael L P，Waters W R，et al.Profiling Bovine Antibody Responses toMycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosisInfection by Using Protein Arrays［J］.Infection and Immunity，2008，76（2）：739－749.