弓形蟲(chóng)單基因和復(fù)合基因疫苗的研究進(jìn)展＊

劉秀華，李英豪，苑文英，藏愛(ài)民，田因詩(shī)，余瑞欣，周雅靜

2.保定市婦幼保健院

弓形蟲(chóng)（Toxoplasmagondii）為專(zhuān)性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲(chóng)，全球分布，能引起人獸共患寄生蟲(chóng)病，全世界的感染率為34%，大多數(shù)為隱性感染，孕婦感染常引起流產(chǎn)、畸胎、死胎，對(duì)于腫瘤患者或AIDS病人等免疫功能受損者，弓形蟲(chóng)是引起死亡的主要原因之一。此外，弓形蟲(chóng)病也給畜牧業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。迄今尚無(wú)治療弓形蟲(chóng)病的特效藥，因此研制安全有效的疫苗極為迫切。由于弓形蟲(chóng)生活史較復(fù)雜，抗原成分具有發(fā)育階段的特異性或差異性，因此發(fā)展多種抗原組合、針對(duì)不同生活史發(fā)育階段的復(fù)合多價(jià)疫苗是研究弓形蟲(chóng)疫苗過(guò)程中的一個(gè)發(fā)展方向與共識(shí)。具有免疫保護(hù)性抗原基因的獲得是基因疫苗研制的基礎(chǔ)工作。已發(fā)現(xiàn)的具有免疫保護(hù)性抗原基因，主要集中在（1）弓形蟲(chóng)表面抗原（SAG）基因；（2）致密顆粒（GRA）基因（3）i蟲(chóng)體棒狀體蛋白（ROP）基因；（4）微線體蛋白（MIC）基因等候選分子上。

1 表面抗原

1.1 SAG1 作為弓形蟲(chóng)速殖子表面的主要抗原之一，是迄今應(yīng)用最多的弓形蟲(chóng)疫苗候選抗原。SAG1蛋白分布于弓形蟲(chóng)速殖子表膜、速殖子內(nèi)以及納蟲(chóng)泡的管狀結(jié)構(gòu)中，約占弓形蟲(chóng)體總蛋白的3%～5%，卻可抑制患者血清中抗體活性的50%，說(shuō)明SAG1含量雖微，卻是速殖子的主要抗原成份，是誘導(dǎo)宿主免疫應(yīng)答的主要靶抗原。能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生IgG，Ig M，IgE，Ig A及sIg A，抗SAG1抗體在體外有殺蟲(chóng)、體內(nèi)有保護(hù)作用，并可誘導(dǎo)產(chǎn)生一些細(xì)胞因子，如γ－干擾素和細(xì)胞毒性淋巴因子，其抗原特異性的CD＋8T細(xì)胞能直接殺傷細(xì)胞外弓形蟲(chóng)，對(duì)弓形蟲(chóng)感染的腹腔巨噬細(xì)胞亦具有細(xì)胞毒性。

1.2 SAG2可使弓形蟲(chóng)固定于有核細(xì)胞的表面，并輔助弓形蟲(chóng)進(jìn)入有核細(xì)胞，介導(dǎo)弓形蟲(chóng)速殖子的入侵過(guò)程?？筍AG2蛋白抗體也可以阻斷弓形蟲(chóng)的再定位，還有可能在弓形蟲(chóng)速殖子向緩殖子轉(zhuǎn)化過(guò)程中起作用。SAG2也具有一定的免疫誘導(dǎo)作用，有高世同等［1］研究表明，用編碼SAG2的基因構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒PBK/SAG2，免疫接種BALB/c小鼠，5周后，取鼠脾細(xì)胞作Con A刺激淋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)及T細(xì)胞亞群測(cè)定，結(jié)果CD＋8T細(xì)胞明顯增多，顯示SAG2蛋白可刺激機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答。

1.3 SAG3最長(zhǎng)編碼有385個(gè)氨基酸殘基，它含有一個(gè)疏水的NH2末端及一個(gè)GPI錨定位點(diǎn)，它在速殖子、緩殖子及子孢子等多個(gè)時(shí)期均有表達(dá)。最新研究表明SAG3的主要功能是參與蟲(chóng)體的增殖，但在弓形蟲(chóng)入侵和增殖的過(guò)程中，SAG3究竟起了什么作用，目前并不清楚［1］。

1.4 SAG4由516個(gè)核苷酸編碼的大小為172個(gè)氨基酸的表面蛋白組成，分子量為18 k D，N端疏水區(qū)為27個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，C末端疏水區(qū)為GPI錨定信號(hào)。

2 棒狀體蛋白

2.1 ROP1在侵入宿主細(xì)胞的早期影響宿主細(xì)胞的通透性。ROP1基因具高度保守性，體外擴(kuò)增出的弓形蟲(chóng)RH、ZS1、ZS2及GT14蟲(chóng)株的ROP1的基因片段，大小為756 bp，蟲(chóng)株間未見(jiàn)明顯差異。

2.2 ROP2主要協(xié)助蟲(chóng)體入侵宿主細(xì)胞，在弓形蟲(chóng)生活史的速殖子期、緩殖子期和子抱子期中均有表達(dá)，具有高度的保守性和免疫原性。Saavedral等研究ROP2抗原中被T細(xì)胞識(shí)別表位時(shí)發(fā)現(xiàn)，弓形蟲(chóng)ROP2抗原包含有被多數(shù)免疫個(gè)體所識(shí)別的T細(xì)胞表位（197－216、393－410、501－524）；表位識(shí)別試驗(yàn)結(jié)果顯示，多肽197－216能被45%弓形蟲(chóng)患者的外周血單核細(xì)胞所識(shí)別，多肽501－524能被36%患者的外周血單核細(xì)胞所識(shí)別，多肽393－410的識(shí)別率為9%，且三者都不能被弓形蟲(chóng)病陰性健康者所識(shí)別，說(shuō)明它有作為疫苗候選因子的巨大潛力。在vercammen M［3］等的研究中，含ROP2的重組質(zhì)?？纱碳ば∈螽a(chǎn)生部分保護(hù)效果，且可使C3H系小鼠抵抗致死性經(jīng)口弓形蟲(chóng)感染。

3 致密顆粒蛋白

GRA在宿主與寄生蟲(chóng)的相互作用中起重要作用，對(duì)人體和動(dòng)物具有較強(qiáng)的免疫反應(yīng)性和免疫原性，在弓形蟲(chóng)病診斷和免疫預(yù)防的研究中受到廣泛關(guān)注。

3.1 GRA2分子量為28.5 k Da，在編碼區(qū)有一個(gè)內(nèi)含子，內(nèi)部存在螺旋結(jié)構(gòu)，為兩個(gè)不同性質(zhì)的α－螺旋。其抗原性很強(qiáng)，用純化的GRA2免疫小鼠，抗攻擊感染的小鼠存活率為75%。目前研究表明GRA2在急慢性弓形蟲(chóng)感染血清中普遍存在，至少存在3個(gè)B細(xì)胞表位和1個(gè)T細(xì)胞表位，可誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生IgG，Ig M，Ig A多種抗體，激活GRA2特異性的CD＋4T細(xì)胞，誘導(dǎo)機(jī)體的保護(hù)性免疫。

3.2 GRA 3基因?yàn)閱慰截?，其cDNA在N一末端編碼2個(gè)蛋氨酸，相鄰有1個(gè)開(kāi)放閱讀框。富含脯氨酸，不含內(nèi)含子，在體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平很高，可用于弓形蟲(chóng)病的診斷和作為疫苗的候選分子。薛書(shū)江等［4］成功建立了真核表達(dá)質(zhì)粒p VAX－GRA3，并采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體將p VAX－GRA3質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入Hela細(xì)胞。RT－PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，GRA3基因在Hela細(xì)胞中得到有效轉(zhuǎn)錄，表明陽(yáng)離子脂質(zhì)體成功地將p VAX－GRA3轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞。而GRA 3基因的表達(dá)蛋白是否具有較好的反應(yīng)原性和免疫原性，還需進(jìn)一步探討。

3.3 GRA7 Velmurugan等［5］在大腸埃希菌中重組表達(dá)了弓形蟲(chóng)GRA7，免疫印跡和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定證明重組GRA7具有良好的反應(yīng)原性，可用于弓形蟲(chóng)急性感染的診斷。Sadeghiani等［6］重組表達(dá)了弓形蟲(chóng)GRA7，免疫印跡分析表明重組GRA7能與弓形蟲(chóng)急性感染人血清反應(yīng)，與慢性感染血清反應(yīng)弱，陰性血清無(wú)反應(yīng)，提示重組GRA7可用于研制弓形蟲(chóng)感染的診斷試劑盒。皮內(nèi)免疫GRA1和GRA7 DNA疫苗混合物產(chǎn)生高滴度的抗GRA1、GRA7及弓形蟲(chóng)裂解產(chǎn)物的抗體，攻擊感染后檢測(cè)到淋巴細(xì)胞增殖和IFN－γ生成，提示DNA疫苗可有效抵抗弓形蟲(chóng)感染［7］。這些研究已證明，弓形蟲(chóng)GRA7是弓形蟲(chóng)病的一種重要診斷抗原和疫苗候選抗原。

4 微線體蛋白

目前已知的微線體蛋白有15種以上，包括MIC1－MIC12、AMA1、Tg－SUB1、Tg－SUB2等，大多含有類(lèi)似真核細(xì)胞黏附分子的保守結(jié)構(gòu)域，如血小板結(jié)合蛋白樣結(jié)構(gòu)域、整合素A樣結(jié)構(gòu)域、表皮生長(zhǎng)因子樣結(jié)構(gòu)域、幾丁質(zhì)連接樣結(jié)構(gòu)域和蘋(píng)果樣基序等。

4.1 MIC3是一種大小為90 k D蛋白，參與蟲(chóng)體與宿主細(xì)胞間的黏附過(guò)程，且在弓形蟲(chóng)速殖子、緩殖子和子孢子3個(gè)感染階段都有表達(dá)。MIC3在早期能夠誘導(dǎo)小鼠和人分泌高效價(jià)的IgG抗體以及IFN－γ、IL－2、IL－4和IL－10等細(xì)胞因子，使機(jī)體產(chǎn)生高強(qiáng)度的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，作為疫苗候選分子具有巨大的潛力。

4.2 MIC4在弓形蟲(chóng)生活史的所有感染階段中均有表達(dá)，基因全長(zhǎng)1 743bp，無(wú)內(nèi)含子，單拷貝。與宿主細(xì)胞相連，其C端的App6結(jié)構(gòu)具有黏附功能。Beghetto［8］等構(gòu)建了含MIC4等5種微線體基因片斷的質(zhì)粒，經(jīng)研究表明此質(zhì)粒產(chǎn)生了很好的免疫保護(hù)性，預(yù)示著MIC4作為一種疫苗組分的可行性。同樣，在Lourenco［9］等的研究中，MIC4亦觸發(fā)了良好的免疫反應(yīng)，促使機(jī)體多種細(xì)胞因子如IL－2，IL－12，IFN－γ，IL－10等水平上升。

4.3 MIC8是一個(gè)單基因拷貝序列，無(wú)內(nèi)含子，它所編碼的蛋白是MIC3蛋白的護(hù)送蛋白，在速殖子和緩殖子期都有表達(dá)，可幫助MIC3蛋白到達(dá)微線體并分泌出胞。Meissner等用EGF樣結(jié)構(gòu)域序列搜索剛地弓形蟲(chóng)表達(dá)序列標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)MIC8含有一個(gè)幾丁質(zhì)樣區(qū)和十個(gè)EGF樣結(jié)構(gòu)域。EGF結(jié)構(gòu)域是表皮生長(zhǎng)因子序列內(nèi)部的功能域，而許多蛋白也有EGF樣結(jié)構(gòu)域，它們與EGF的氨基酸序列和受體識(shí)別能力相似并執(zhí)行類(lèi)似的功能。EGF受體是啟動(dòng)酪氨酸激酶信號(hào)傳導(dǎo)通路的重要分子，在很多細(xì)胞都有表達(dá)。EGF與受體結(jié)合后可激活受體蛋白酪氨酸激酶，進(jìn)而激活一系列反應(yīng)，最終導(dǎo)致合成RNA，蛋白質(zhì)和脂類(lèi)，復(fù)制DNA，細(xì)胞分裂。EGF/EGFR可能是低免疫人群對(duì)弓形蟲(chóng)易感的重要分子基礎(chǔ)之一。MIC8作為微線體蛋白中EGF樣結(jié)構(gòu)域含量較高者，很有可能在弓形蟲(chóng)粘附宿主細(xì)胞的過(guò)程中起著重要的作用。最新研究表明，當(dāng)MIC8不存在的時(shí)候，蟲(chóng)體不能與宿主細(xì)胞形成接觸融合區(qū)域，使得侵入宿主細(xì)胞過(guò)程受阻，這種由MIC8參與形成的細(xì)胞融合區(qū)域非常重要，不可被其他的微線體蛋白來(lái)替代，從而表明MIC8是一種新穎的，功能獨(dú)特的蛋白。另外，MIC8參與的信號(hào)級(jí)放大反應(yīng)，也與棒狀體蛋白的分泌有關(guān)［10］。

4.4 AMA1是弓形蟲(chóng)的一個(gè)重要抗原，與蟲(chóng)體入侵宿主細(xì)胞的功能密切相關(guān)，從弓形蟲(chóng)基因組中敲除AMA1基因，可明顯降低弓形蟲(chóng)對(duì)宿主細(xì)胞的入侵能力。AMA1是保守的抗原蛋白［11］，能誘導(dǎo)特異性的Th1型免疫應(yīng)答，是最有希望的抗弓形蟲(chóng)感染的候選疫苗之一。利用脂質(zhì)體將pcDNA3.1－AMA1導(dǎo)入真核細(xì)胞人胚胎腎細(xì)胞（HEK293細(xì)胞）中，經(jīng) Western blotting鑒定，AMA1基因在HEK293細(xì)胞中成功表達(dá)，并且能被特異性重組蛋白免疫血清所識(shí)別，說(shuō)明AMA1蛋白在體外表達(dá)后具有一定的免疫活性，從而為進(jìn)一步應(yīng)用AMA1－DNA疫苗免疫試驗(yàn)動(dòng)物和鑒定DNA疫苗的免疫效果奠定了基礎(chǔ)。

5 復(fù)合基因疫苗

5.1 RH 株 弓 形 蟲(chóng) 復(fù) 合 基 因 質(zhì) 粒pc DNA3.1－SAG1－ROP2－GRA2［12］，并驗(yàn)證重組質(zhì)粒在 Hela細(xì)胞中的表達(dá)后，以肌注方式接種BALB/c小鼠，測(cè)定血清中IgG的量、免疫小鼠脾細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子的濃度及淋巴轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，并用RH株弓形蟲(chóng)速殖子對(duì)免疫小鼠進(jìn)行攻擊感染實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該質(zhì)粒誘發(fā)機(jī)體的全面免疫應(yīng)答，免疫動(dòng)物產(chǎn)生高濃度的IgG抗體，細(xì)胞免疫呈Th1型，分泌INF－γ，而無(wú)IL－4產(chǎn)生，淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)及NK細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)表明集體的非特異性免疫水平也有所提高，免疫小鼠能延長(zhǎng)感染后小鼠的生存時(shí)間。質(zhì)粒pcDNA3.1－SAG1－ROP2－GRA2的免疫效果優(yōu)于 pcDNA3.1－SAG1－ROP2 及 pcDNA3.1－SAG1－GRA2。mIL－12對(duì)該基因的免疫效果起了很好的增強(qiáng)作用。

5.2 趙紅［13］采用弓形蟲(chóng)速殖子表面抗原SAG1與ROP2基因定向連接并構(gòu)建在同一真核表達(dá)載體，通過(guò)滴鼻粘膜免疫小鼠，LTB作為免疫佐劑增強(qiáng)免疫效果。結(jié)果顯示，弓形蟲(chóng)速殖子復(fù)合基因疫苗pcDNA3.1－SAG1－ROP2 質(zhì) 粒 和 p EASY－E1－LTB質(zhì)粒共同免疫較復(fù)合基因疫苗單獨(dú)免疫具有更好的免疫效果，其不僅能刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的系統(tǒng)免疫應(yīng)答，而且也可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的局部黏膜免疫應(yīng)答。

5.3 姚遠(yuǎn)［14］通過(guò)基因重組構(gòu)建了真核表達(dá)重組質(zhì)粒pcDNA3.1－SAG1－MIC8，與 單 基 因 質(zhì) 粒 pcDNA3.1－SAG1及pcDNA3.1－MIC8免疫小鼠，以研究復(fù)合基因疫苗效果。實(shí)驗(yàn)中復(fù)合基因組總IgG抗體、特異性IgG抗體及細(xì)胞因子IFN－γ的數(shù)量均高于單基因免疫組，驗(yàn)證了復(fù)合基因疫苗較之單基因疫苗具有更好的免疫效果。

6 猜 想

SAG1、ROP2和GRA2三者的復(fù)合基因疫苗、SAG1和ROP 2二者的復(fù)合基因疫苗及SAG1和MIC8二者的復(fù)合基因疫苗均比各自組成成分的單基因疫苗有更好的免疫效果。而MIC8參與形成的細(xì)胞融合區(qū)域非常重要，不可被其他的微線體蛋白來(lái)替代，也與棒狀體蛋白的分泌有關(guān)。由此猜測(cè)SAG1－ROP2－MIC8復(fù)合基因疫苗對(duì)弓形蟲(chóng)具有更好的免疫效果。

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