增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變動(dòng)物模型的改進(jìn)和評(píng)價(jià)

趙紅梅，盛敏杰，于 靖

（同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院眼科，上海 200072）

增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變（proliferative vitreoretinopathy，PVR）是導(dǎo)致視網(wǎng)膜脫離手術(shù)失敗的主要原因之一。眼外傷或者視網(wǎng)膜破裂后，RPE細(xì)胞、müller細(xì)胞等從原位遷移至玻璃體腔發(fā)生增殖和收縮。在此過程中，細(xì)胞因子大量產(chǎn)生，膠原和纖維樣物質(zhì)大量堆積，形成視網(wǎng)膜前膜或視網(wǎng)膜下膜，從而引起牽引性視網(wǎng)膜脫離，嚴(yán)重影響視力［1］。根據(jù)其病理過程，人們建立各種不同類型的PVR模型，以更好的研究該病的發(fā)病機(jī)制和防治。

1 模型中常用的動(dòng)物

1.1 兔子

兔子因?yàn)樾郧闇仨?、眼球大，晶狀體相對(duì)小、玻璃體腔體積相對(duì)較大，便于進(jìn)行眼科手術(shù)操作和觀察等優(yōu)點(diǎn)而成為PVR模型中最常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。最常用的品種是新西蘭白兔、青紫藍(lán)兔、中國(guó)本種兔等。但是缺點(diǎn)是：兔子和人類的眼底構(gòu)造稍有不同，兔子沒有黃斑中心凹，存在髓線?？傮w而言，PVR比較容易發(fā)生。

1.2 鼠類

大鼠和小鼠也可用于PVR模型，鼠類具有繁殖能力強(qiáng)、飼養(yǎng)管理方便，易于控制、遺傳基因組和組織解剖結(jié)構(gòu)和人相似性高等優(yōu)點(diǎn)。目前在PVR小鼠模型中應(yīng)用最多的是C57BL/6J小鼠，常用于PVR大鼠模型中的封閉群有：Wistar、Spraque-Dawley大鼠、Brown-Norway大鼠，近交系有Lewis大鼠。大鼠和小鼠應(yīng)用于此模型的缺點(diǎn)是：眼球體積小，晶狀體接近于球形，玻璃體腔體積相對(duì)較小，不易于玻璃體腔注射等操作，而且觀察不方便。

1.3 其他動(dòng)物

小型豬、貓以及靈長(zhǎng)類動(dòng)物等也可用于PVR動(dòng)物模型的建立，但是由于倫理、價(jià)格等原因而應(yīng)用較少。

2 PVR動(dòng)物模型的建立方法

為了研究PVR的病理發(fā)展過程和治療，現(xiàn)在已不止有25種模型的建立方法［2］。

2.1 玻璃體腔注入細(xì)胞

由于玻璃體腔注射后會(huì)發(fā)生高眼壓等并發(fā)癥，大多數(shù)學(xué)者在玻璃體腔注射之前會(huì)先行玻璃體切割，可以用氣體壓迫、手術(shù)機(jī)械性切割［3］等方式，也可以先注射透明質(zhì)酸酶待玻璃體液化［4］，以利于細(xì)胞在玻璃體腔的移行，促進(jìn)PVR的發(fā)生。PVR以及牽引性視網(wǎng)膜脫離的程度與注入的細(xì)胞數(shù)量呈劑量-效應(yīng)關(guān)系，根據(jù)這一關(guān)系，可選擇出注入細(xì)胞的合適數(shù)量，制成相應(yīng)的模型。

2.1.1 RPE細(xì)胞：這是PVR動(dòng)物模型造模方法中最常用的方法之一。這種方法可以模擬RPE細(xì)胞在玻璃體內(nèi)的增殖、移行和分化等過程，而且RPE細(xì)胞能分泌多種細(xì)胞因子，促進(jìn)膠原和纖維的形成，形成明顯的視網(wǎng)膜前膜，很好的突出了疾病的本質(zhì)，并且可以進(jìn)行定性、定量研究，可重復(fù)性強(qiáng)?？梢杂米泽w同源、同種異體或者異種的RPE細(xì)胞。為了提高造模成功率也可以聯(lián)合富含血小板血漿或者müller細(xì)胞。

2.1.2 成纖維細(xì)胞：將成纖維細(xì)胞注入玻璃體切割后的眼內(nèi)，也可制作成典型的PVR模型。成纖維細(xì)胞注入眼內(nèi)后，就會(huì)以殘余的玻璃體膠原和透明質(zhì)酸為支架生長(zhǎng)繁殖，形成模樣物，牽拉下方的視網(wǎng)膜，造成后部PVR。成纖維細(xì)胞容易獲取，培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)良好。細(xì)胞可以取自自體或異體的皮膚［5］、結(jié)膜［6］等組織。異體和自體成纖維細(xì)胞的結(jié)果在時(shí)間和程度方面無差異。并且此模型容易重復(fù)，這種造模方法也備受青睞。

2.1.3 巨噬細(xì)胞：巨噬細(xì)胞是一種終末細(xì)胞，不能轉(zhuǎn)化和增生，但它們能分泌多種細(xì)胞因子。將巨噬細(xì)胞注射到玻璃體腔也能形成PVR動(dòng)物模型［7］。在此模型中，眼內(nèi)的增生細(xì)胞如RPE細(xì)胞等均來自宿主自身，這種模型以炎癥啟動(dòng)階段為起點(diǎn)，可用于觀察早期的炎性細(xì)胞因子的含量變化及對(duì)細(xì)胞增生的調(diào)控作用。而且巨噬細(xì)胞的采集和純化相對(duì)簡(jiǎn)單。

2.1.4 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞：將神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞注入大鼠玻璃體腔也可以建立PVR模型。Francine等［8］在大鼠玻璃體腔單一注射RPE細(xì)胞、müller細(xì)胞以及聯(lián)合注射，發(fā)現(xiàn)在大鼠PVR模型中，müller細(xì)胞誘導(dǎo)PVR的能力大于RPE細(xì)胞，而且聯(lián)合注射明顯優(yōu)于單一細(xì)胞注射。

2.1.5 其他類型細(xì)胞：內(nèi)皮細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、胚胎細(xì)胞等也可以用于PVR建模［9］。但是由于此過程與PVR自然發(fā)病過程相距甚遠(yuǎn)，實(shí)際應(yīng)用較少。

2.2 玻璃體腔注射富含血小板血漿或富含血小板血漿聯(lián)合細(xì)胞

富含血小板血漿（platelet-rich-plasma，PRP）中富含大量的血小板，血小板可以分泌多種細(xì)胞因子，比如PDGF、TGF等，這些因子可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖、纖維的形成，促進(jìn)纖維向視網(wǎng)膜粘附，形成PVR模型。

PRP聯(lián)合細(xì)胞注入玻璃體腔時(shí)，PRP中細(xì)胞因子的釋放對(duì)注入細(xì)胞有促增生、促粘附的作用，能更好的建立PVR模型。Zheng等［10］嘗試了在大鼠玻璃體腔單純注射RPE-J細(xì)胞、玻璃體腔單純注射PRP、玻璃體腔聯(lián)合注射RPE-J細(xì)胞和PRP三種方法來建立大鼠PVR模型，最后發(fā)現(xiàn)玻璃體腔聯(lián)合注射的建模成功率明顯高于單獨(dú)注射。

2.3 較大鞏膜切口制成的PVR模型

有鞏膜切口存在時(shí)，眼部的細(xì)胞如RPE細(xì)胞等直接暴露于玻璃體環(huán)境中，由于微環(huán)境的改變，RPE細(xì)胞發(fā)生遷移和增生，轉(zhuǎn)化成成纖維細(xì)胞，有收縮膠原和纖維的活性。與人孔源性視網(wǎng)膜脫離引起的PVR發(fā)生過程相似，聯(lián)合玻璃體腔注射細(xì)胞或者富含血小板血漿等操作能成功的建立PVR動(dòng)物模型，但是外傷性PVR模型是人為的造成網(wǎng)脫，并不是由于玻璃體牽引引起的裂孔，而且手術(shù)操作復(fù)雜，影響因素較多，難以定量，病變程度的一致性和模型的可重復(fù)性較差。

由較大鞏膜穿孔傷以及眼后段穿孔傷制成的PVR模型與人外傷所致的PVR的發(fā)生相似，但這一模型由于血液存留在玻璃體內(nèi)，使早期眼底窺不清，不利于早期觀察。

2.4 dispase酶消化法

dispase是細(xì)胞實(shí)驗(yàn)時(shí)常用的一種分解組織的酶，可以選擇性的降解四型膠原和纖維連接蛋白，降解細(xì)胞外基質(zhì)，為細(xì)胞的移行和分化創(chuàng)造條件。注射時(shí)，或多或少都有出血的發(fā)生，血液中的淋巴細(xì)胞、血小板等都參與了PVR的發(fā)生。Elizabeth等［11］首次報(bào)道了可以用dispase建立PVR模型，而且玻璃體腔或者視網(wǎng)膜下腔注射dispase，都可以成功建立PVR的兔模型，最佳劑量是0.05U～0.07U。dispase用量小，價(jià)格便宜，且建模操作簡(jiǎn)單，對(duì)動(dòng)物的創(chuàng)傷小，而且不需要引入外源的細(xì)胞成分，與臨床PVR更接近。但是這種造模方法有較多的副作用［12］，比如晶體脫位、白內(nèi)障等。因?yàn)閮?nèi)界膜成分和基底膜非常相似，dispase分解基底膜的同時(shí)也破壞了內(nèi)界膜的本身結(jié)構(gòu)，使müller細(xì)胞足板暴露［13］，在使用dispase建立PVR模型時(shí)要考慮到這些副作用。

2.5 玻璃體腔注射細(xì)胞因子

細(xì)胞因子如IL-1β、PDGF等可以促進(jìn)RPE細(xì)胞等的增殖、遷移、分化等活性，將其注射到玻璃體腔也可以造成PVR模型。Gregory等［14］在外力造成視網(wǎng)膜裂孔后，將IL-1β注入玻璃體腔，也可以造成兔PVR模型，但是這種造模方法由于引入了外源性的細(xì)胞因子，與臨床所見的PVR的發(fā)生發(fā)展過程較大差異，因此限制了這種方法的使用。

2.6 其他方法

Shizuya等將小鼠的晶體摘除，直接外力損傷RPE細(xì)胞層，也可以造成小鼠前部PVR模型［15］，但是模型與臨床PVR相差甚遠(yuǎn)，應(yīng)用有限；此外在鞏膜傷后向玻璃體腔注入全血［16］或者血小板［17］也能誘導(dǎo)PVR的發(fā)生，但是所需時(shí)間比較長(zhǎng)，增生程度輕；也有學(xué)者用眼內(nèi)異物造模，但是鐵等異物的存在會(huì)造成視網(wǎng)膜明顯的毒性作用；也可用轉(zhuǎn)基因［18］］的方法來誘導(dǎo)細(xì)胞因子的表達(dá)從而形成PVR，但此法對(duì)實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)的要求較高。

3 PVR模型評(píng)價(jià)方法和分級(jí)

3.1 模型的評(píng)價(jià)方法

PVR建模后一周內(nèi)每天用直接眼底鏡或間接眼底鏡觀察眼底，之后每周觀察一次眼底，觀察周期一般是28d以上，眼底鏡檢查主觀性較強(qiáng)。也可以用眼科B超來輔助診斷有無PVR的發(fā)生，適用于兔子等眼球較大的動(dòng)物，但是鼠類眼球小，一般的B超探頭難以分辨模型建立與否。也可以選擇用光學(xué)相干斷層掃描（optical coherence tomography，OCT）或者視網(wǎng)膜電圖（electroretinogram，ERG）來評(píng)價(jià)模型，此外，螺旋CT可以對(duì)兔眼PVR模型中增殖膜的密度等進(jìn)行定性和定量分析［19］。在諸多方法中，最客觀的評(píng)價(jià)方法是組織病理切片，可以從組織學(xué)角度客觀的評(píng)價(jià)模型建立與否。

3.2 模型的分級(jí)

在兔PVR模型的分級(jí)中，應(yīng)用最多的是Fasternburg分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)［20］。該標(biāo)準(zhǔn)共有五個(gè)等級(jí)：I級(jí)眼底正常，玻璃體內(nèi)可見增殖條帶；Ⅱ級(jí)局灶性牽拉，局限性血管改變，充血擴(kuò)張等；Ⅲ級(jí)髓線處的局限性網(wǎng)脫以及視網(wǎng)膜皺褶；Ⅳ級(jí)廣泛的視網(wǎng)膜脫離，全部髓線脫離，視盤周圍視網(wǎng)膜脫離；Ⅴ級(jí)視網(wǎng)膜全脫離、對(duì)折以及裂孔形成。

Weiss等［21］將兔PVR模型按照病變程度分為六級(jí)：0級(jí)無增生；0.5級(jí)玻璃體勉強(qiáng)可見增生痕跡；1級(jí)有細(xì)小增生束，但無真正的條索形成；2級(jí)有濃厚的增生束形成；3級(jí)有細(xì)薄的增生條索；4級(jí)有濃厚的增生條索。

我國(guó)的梁厚成等［22］也制定了兔PVR模型的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)：眼底正常未見增生；I級(jí)：玻璃體內(nèi)有少量纖細(xì)的增生條帶；Ⅱ級(jí)：玻璃體內(nèi)有較多粗大的增生條帶；Ⅲ級(jí)：玻璃體內(nèi)有膜狀增生條帶；Ⅳ級(jí)：增生條帶牽拉髓線抬高，或有局部視網(wǎng)膜脫離。

Francine等［8］制定了Lewis大鼠PVR的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)無增殖反應(yīng)；1級(jí)玻璃體內(nèi)增殖；2級(jí)視網(wǎng)膜前膜以及視網(wǎng)膜皺褶形成；3級(jí)視網(wǎng)膜前有致密白膜形成，視網(wǎng)膜皺褶、局限性網(wǎng)脫，伴有或不伴有局限性后囊膜型白內(nèi)障。

Zheng［10］制定了Wistar大鼠PVR模型的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)無增殖反應(yīng)；1級(jí)玻璃體霧狀渾濁，增殖條帶形成；2級(jí)單個(gè)或者多個(gè)象限的視網(wǎng)膜皺褶；3級(jí)單個(gè)象限的視網(wǎng)膜前膜形成；4級(jí)兩個(gè)或兩個(gè)以上象限的視網(wǎng)膜前膜形成。

4 問題與展望

目前PVR模型的所用動(dòng)物還是以兔子為多，且造模方法復(fù)雜，不同的造模方法建立的模型有差異。就實(shí)驗(yàn)效果而言，聯(lián)合注射不同的細(xì)胞或者細(xì)胞和PRP聯(lián)合注射成膜率更高，就實(shí)驗(yàn)操作而言，兔子玻璃體腔較大，易于觀察，而且單純玻璃體腔注射操作相對(duì)容易。實(shí)驗(yàn)者要分析各種方法的利弊，從實(shí)驗(yàn)?zāi)康闹诌x擇合適的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和實(shí)驗(yàn)方法來建立PVR動(dòng)物模型。相信以后會(huì)有簡(jiǎn)單易行而又穩(wěn)定的造模方法出現(xiàn)，以便更好的研究該疾病。

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