小型模式生物在病毒作用機(jī)制研究中的應(yīng)用

沈 琮，何琪楊

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，北京 100050)

小型模式生物在病毒作用機(jī)制研究中的應(yīng)用

沈 琮，何琪楊

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，北京 100050)

小型模式生物如酵母、線蟲、果蠅、斑馬魚等在生命科學(xué)研究中應(yīng)用廣泛，將其應(yīng)用于病毒的研究，使人們對(duì)病毒-宿主的相互作用以及生物體的抗病毒免疫機(jī)制有了新的認(rèn)識(shí)。本文對(duì)這些小型模式生物的特點(diǎn)及其在病毒機(jī)制研究中的應(yīng)用做簡(jiǎn)要介紹。

模式生物;病毒;酵母;線蟲;果蠅;斑馬魚

病毒感染性疾病是嚴(yán)重威脅人類健康的一類重要疾病。盡管對(duì)病毒感染機(jī)體的分子機(jī)制已有很多認(rèn)識(shí)，但病毒與宿主的相互作用以及其細(xì)胞因素調(diào)節(jié)病毒基因表達(dá)的許多規(guī)律尚未得到徹底闡明，這是根治艾滋病、病毒性肝炎等難治性傳染病的瓶頸所在。細(xì)胞培養(yǎng)和建立動(dòng)物感染模型是病毒學(xué)研究的經(jīng)典方法，細(xì)胞培養(yǎng)體系和動(dòng)物模型的缺乏會(huì)嚴(yán)重阻礙對(duì)病毒機(jī)制的研究以及抗病毒藥物的篩選［1］。某些具有嚴(yán)格種屬特異性的病毒(如巨細(xì)胞病毒CMV)，體外培養(yǎng)只能采用自然宿主來源的細(xì)胞系;某些病毒的自然宿主僅為人和靈長(zhǎng)類，需要建立可行的動(dòng)物研究模型;此外，人類龐大的基因組、表觀遺傳學(xué)的修飾以及病毒變異株和新病毒的不斷出現(xiàn)，在一定程度上增加了研究的難度。

模式生物是人們?cè)陂L(zhǎng)期研究生命科學(xué)的過程中建立起來的、可以模擬某個(gè)特定生理或病理過程的重要實(shí)驗(yàn)材料。目前，多種模式生物的基因組測(cè)序已經(jīng)完成，蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和基因表達(dá)數(shù)據(jù)也陸續(xù)建立。除常用的大鼠、小鼠、兔子等大型的模式生物之外，應(yīng)用小型模式生物如酵母、線蟲、果蠅和斑馬魚等的研究，近年來發(fā)展迅速，取得了大量的研究成果。小型模式生物具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、操作方便、生長(zhǎng)繁殖快、飼養(yǎng)成本低等特點(diǎn)，使其在病毒作用機(jī)制的研究中較其它大型模式生物更具優(yōu)勢(shì)。它們的應(yīng)用有力地促進(jìn)了病原學(xué)的發(fā)展，使許多難以解決的人類難題變得明朗。

1 酵母

酵母是簡(jiǎn)單的單細(xì)胞真核生物，約有6000個(gè)基因，1996年酵母全基因組測(cè)序完成后發(fā)現(xiàn)：60%以上為功能基因，其中40%含有與人類基因相似的保守序列。作為模式生物的酵母主要有釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)兩種，二者在細(xì)胞周期調(diào)控的研究中具有重要地位。在病毒研究中使用酵母也取得了大量成果。

酵母基因文庫(kù)可用于大規(guī)模篩選疾病關(guān)聯(lián)基因以及與病毒復(fù)制相關(guān)的宿主蛋白。用酵母篩選到熱休克蛋白Hsp70能夠抑制由HIV-1的輔助蛋白Vpr引起的細(xì)胞周期阻斷，這種抑制作用已在HIV-1感染的人體細(xì)胞中得到證實(shí)［2］。

基于酵母系統(tǒng)已闡明了多種病毒(如人免疫缺陷病毒HIV、丙型肝炎病毒 HCV、EB病毒)中的某些特異蛋白的功能。Vpr在HIV復(fù)制和核運(yùn)送中起重要作用，把Vpr基因轉(zhuǎn)化到酵母中，也觀察到了與在HIV-1感染的人體細(xì)胞中相似的功能，具體表現(xiàn)為增加酵母細(xì)胞壁的幾丁質(zhì)合成、干擾細(xì)胞骨架并改變細(xì)胞極性［3］。雖然 Vpr使細(xì)胞阻斷在 G2期，但不影響紫外線引起的損傷效應(yīng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Vpr影響細(xì)胞周期與 Wee1、PP2A的組分 Ppa2和 Rad24 的表達(dá)有關(guān)［4-6］。

酵母在RNA病毒復(fù)制周期及相關(guān)宿主因子的研究中發(fā)揮了重要作用。首個(gè)利用酵母體系擴(kuò)增的高等真核生物病毒是雀麥花葉病毒(Brome mosaic virus BMV)，一種基因組為單正鏈RNA的植物病毒。之后，一些 DNA病毒如人乳頭瘤病毒HPV、牛乳頭瘤病毒BPV等也在酵母中得到復(fù)制和擴(kuò)增［7］。為研究病毒宿主相互作用、尋找新的抗病毒藥物靶點(diǎn)創(chuàng)造了條件。

在蛋白表達(dá)及藥物篩選中的作用：酵母中表達(dá)的重組乙肝表面抗原已發(fā)展成為廣泛應(yīng)用的乙肝疫苗;某些病毒復(fù)制所必需的宿主蛋白只存在于人體細(xì)胞，而酵母細(xì)胞中沒有相應(yīng)組分，在酵母細(xì)胞中表達(dá)這種蛋白可以建立更為復(fù)雜的類似于“人源化酵母”的病毒感染體系;高通透性細(xì)胞膜酵母株和細(xì)胞膜主要轉(zhuǎn)運(yùn)泵缺失酵母株的建立則使化合物更易進(jìn)入細(xì)胞，提高了抗病毒藥物在酵母體系中的篩選效率［7］。

酵母的核糖體較哺乳動(dòng)物的小，但二者結(jié)構(gòu)非常相似，都含有HCV(丙肝病毒內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn))序列結(jié)合位點(diǎn)，40S亞基同源性達(dá)60%［8］。在不含翻譯起始因子、只含HeLa細(xì)胞核糖體、酵母細(xì)胞延伸因子1A、2和大量氨酰tRNA的重組系統(tǒng)中，HCV IRES介導(dǎo)的翻譯仍可發(fā)生［9］。利用雙順反子表達(dá)載體pFGAL4，在酵母細(xì)胞中能夠檢測(cè)到 HCV IRES的翻譯活性［10］。pFGAL4載體由多重表達(dá)質(zhì)粒改建而成，含有一個(gè)磷酸丙糖異構(gòu)酶強(qiáng)啟動(dòng)子，以保證螢火蟲熒光素酶基因和GAL4基因雙順反子mRNA的高水平表達(dá)。在含有IRES的順反子區(qū)域，Gal4轉(zhuǎn)錄因子是該區(qū)信號(hào)放大的保證。即使在只有少量的第二順反子表達(dá)、即細(xì)胞中僅存在少量活性Gal4分子的情況下，Gal4誘導(dǎo)型啟動(dòng)子也會(huì)啟動(dòng)大量的次生報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄，使信號(hào)成比例放大。這種雙順反子表達(dá)系統(tǒng)利用了酵母在進(jìn)化過程中自然形成的半乳糖代謝調(diào)節(jié)通路，嚴(yán)格準(zhǔn)確、結(jié)果可靠。通過測(cè)定裂解產(chǎn)物中 -gal/luc酶活性比值和活細(xì)胞在選擇性SD培養(yǎng)基(缺乏腺嘌呤和組氨酸，富含組氨酸合成的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑3-AT)上的克隆形成率判斷得知HCV IRES在酵母中仍有起始翻譯的活性。為進(jìn)一步明確HCV IRES功能，篩選新型抗病毒藥物提供了新的模型。

此外，酵母雙雜交系統(tǒng)是研究蛋白相互作用的有利工具，利用該系統(tǒng)已檢測(cè)到了多種病毒蛋白與宿主蛋白的相互作用［11］，加深了人們對(duì)病毒致病機(jī)制的了解。

2 秀麗隱桿線蟲

秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)作為模式生物早在40多年前由Sydney Brenner博士提出，它是由單細(xì)胞生物進(jìn)化而來的最簡(jiǎn)單的多細(xì)胞模式生物。成體線蟲長(zhǎng)約1 mm，為雌雄同體?？稍诃傊囵B(yǎng)基上培養(yǎng)，以大腸桿菌為食。大約含有1 000個(gè)體細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)和遺傳背景清楚。繁殖數(shù)200～300，25℃兩天可長(zhǎng)為成體。低溫液氮冷藏可保存數(shù)年。線蟲基因組大約包含兩萬個(gè)基因，其中60%與其它物種的已知基因具有同源性。多種病毒可以感染線蟲，并在線蟲體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和裝配，RNA病毒基因可被經(jīng)典的RNA干擾途徑沉默［12］。盡管線蟲不產(chǎn)生獲得性免疫且沒有類似的巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞，從整體水平研究宿主與病原體相互作用仍是良好的模型。

近年來廣泛研究的RNA干擾現(xiàn)象，是否為哺乳類抗病毒的防御機(jī)制未見定論，使用沒有免疫系統(tǒng)的線蟲進(jìn)行研究，解決了上述問題。用水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)感染 RNAi機(jī)制缺陷的線蟲突變體，可產(chǎn)生大量的病毒;而感染加強(qiáng)RNAi反應(yīng)的突變體，病毒顆粒的產(chǎn)生被抑制［13］，表明 RNAi的機(jī)制與抗病毒免疫密切相關(guān)。使用另一種具有廣泛宿主，能在酵母、植物、昆蟲和哺乳類細(xì)胞中復(fù)制的獸棚病毒(flock house virus)感染線蟲，也得到了相似的結(jié)論［14］。進(jìn)一步研究表明，線蟲除了表達(dá) dicer酶外還編碼三種dicer相關(guān)的解旋酶(drh)，此種酶與哺乳動(dòng)物中能夠廣泛激活先天性免疫反應(yīng)的RIG-I樣RNA解旋酶受體關(guān)系密切。在drh-2突變的線蟲中，外來雙鏈RNA介導(dǎo)的RNAi和病毒復(fù)制子介導(dǎo)的RNAi均增強(qiáng)，但在drh-1突變的線蟲中，外源性 RNAi卻無變化，提示外源性和病毒性RNAi途徑在基因水平存在差異［15］。

HSV VP16蛋白的作用靶點(diǎn)是一類小而關(guān)鍵的基因家族，包括哺乳動(dòng)物中的 HCF-1、HCF-2和線蟲中的Ce HCF-1，它們?cè)诜肿铀礁叨缺Ｊ亍CF-1是單純皰疹病毒宿主細(xì)胞因子，在HSV感染的細(xì)胞中，HCF-1與病毒蛋白VP16相互作用，共同促進(jìn)DNA–蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合物的形成。hcf-1基因缺陷的線蟲不能形成VP16介導(dǎo)的復(fù)合物，說明線蟲中的Ce HCF-1是 HSV VP16作用的唯一靶點(diǎn)［16］。HCF與HSV VP16的相互作用在多種動(dòng)物中的保守性，一定程度上反映了自然選擇和病毒感染對(duì)細(xì)胞進(jìn)化的共同影響。

3 黑腹果蠅

果蠅(Drosophila melanogaster)在分類學(xué)上屬于昆蟲綱雙翅目，生活周期包括卵、幼蟲、蛹和成蟲四個(gè)完全變態(tài)的發(fā)育階段，其中幼蟲又分為一齡、二齡及三齡，從初生卵發(fā)育至新羽化的成蟲大約為10 d。清晰的遺傳背景和便捷的遺傳操作使其成為一種理想的模式生物，廣泛應(yīng)用于發(fā)育生物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等領(lǐng)域［17］。

相對(duì)于酵母和線蟲而言，果蠅已具有與人NF-kB免疫信號(hào)通路相類似的抗病毒Toll通路。HIV的輔助蛋白Vpu，通過與 SCF復(fù)合體的相互作用而干擾蛋白的降解，將Vpu基因轉(zhuǎn)化到果蠅的脂肪細(xì)胞中，可抑制Toll信號(hào)通路的活化［18］。在HIV感染早期起作用的Nef蛋白的功能，仍存在爭(zhēng)議。把Nef基因轉(zhuǎn)化到果蠅中，發(fā)現(xiàn)Nef不僅參與細(xì)胞增殖的調(diào)解，同時(shí)也誘導(dǎo) Caspase依賴的細(xì)胞凋亡;Nef的功能與活化JNK信號(hào)通路，抑制NF-kB免疫反應(yīng)有關(guān)［19］。把HIV的Tat蛋白注射到果蠅的胚胎中，觀察到Tat與微管的結(jié)合，干擾細(xì)胞周期M期的運(yùn)行，明顯增加多倍體和異倍體的細(xì)胞［20］，此后在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中也檢測(cè)到Tat的相似作用。表達(dá)SARS冠狀病毒3a蛋白的果蠅可出現(xiàn)粗眼表型，利用這種轉(zhuǎn)基因模型發(fā)現(xiàn)3a蛋白參與了細(xì)胞內(nèi)依賴網(wǎng)格蛋白的內(nèi)吞作用，并可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞色素 C水平和caspase活性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［21］。而在FHV感染的果蠅細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)凋亡抑制因子DIAP明顯減少。通過RNAi方式抑制 diap1，細(xì)胞迅速凋亡，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染diap1抑制caspase活性則可阻止FHV感染引起的凋亡。由此推斷病毒誘導(dǎo)的凋亡也可能是通過改變細(xì)胞中凋亡抑制因子的水平和活性來實(shí)現(xiàn)的［22］?？傊?，研究病毒蛋白對(duì)整體動(dòng)物的影響，果蠅是一種比較適合的模型［23］。

隨著果蠅中大量人類致病基因同源序列的發(fā)現(xiàn)以及對(duì)轉(zhuǎn)基因果蠅的研究，果蠅已被廣泛用于闡釋機(jī)體針對(duì)病毒的多種先天性免疫機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，果蠅對(duì)Nora病毒的感染具有閾值依賴現(xiàn)象［24］：高滴度病毒感染可產(chǎn)生穩(wěn)定的持續(xù)感染，而低水平病毒感染后可被完全清除。而且這種閾值依賴現(xiàn)象在RNAi通路突變株、Toll和 Jak-Stat通路突變株中仍然存在。這種RNA病毒不受RNAi機(jī)制影響且對(duì)其他免疫通路也不敏感，尚需進(jìn)一步探索。

4 斑馬魚

斑馬魚(Danio rerio)作為模式生物用于研究脊椎動(dòng)物的發(fā)育已有20多年的歷史。其特點(diǎn)是體型小，生長(zhǎng)快，幼體可在24 h孵化，可以生長(zhǎng)在96孔板中，生命周期短且早期胚胎透明易于觀察，飼養(yǎng)成本是小鼠的1% ～1‰。盡管利用細(xì)胞培養(yǎng)及線蟲、果蠅模型可以解決一些病原體與宿主反應(yīng)的基本問題，但是由于缺乏脊椎動(dòng)物復(fù)雜的免疫系統(tǒng)，這些模型對(duì)哺乳動(dòng)物體內(nèi)疾病進(jìn)程的模擬程度有限［25］。而利用斑馬魚研究病原體-宿主相互作用可以很好地補(bǔ)充無脊椎動(dòng)物模型和小鼠模型的不足。一方面，斑馬魚具有與哺乳動(dòng)物類似的免疫因子和通路，不僅具備B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、抗原提呈細(xì)胞和能產(chǎn)生活性NO和活性氧自由基的吞噬細(xì)胞，還具有體液免疫的基本要素如補(bǔ)體等，以及類似于哺乳動(dòng)物Toll樣受體(TLR)和Nod樣受體的同源蛋白，在微生物感染后可以激活特定細(xì)胞因子的表達(dá)［26］。另一方面，斑馬魚具有操作簡(jiǎn)單、成本低廉、生長(zhǎng)周期短、基因背景清楚等特點(diǎn)，隨著對(duì)轉(zhuǎn)基因和基因敲除魚研究的不斷增加，利用斑馬魚建立細(xì)菌和病毒的感染模型備受關(guān)注。利用相差顯微鏡可以觀察到斑馬魚的吞噬細(xì)胞將注入胚胎的細(xì)菌吞噬并摧毀的整個(gè)過程［27］;結(jié)核分枝桿菌感染的斑馬魚可以模擬人的結(jié)核病，產(chǎn)生肉芽腫樣變［28］;葡萄球菌、鏈球菌和李斯特菌也有相應(yīng)的斑馬魚模型［29］。目前利用斑馬魚建立了傳染性造血器官壞死病病毒(infectious hematopoietic necrosis virus，IHNV)、傳染性胰臟壞死病毒(infectious pancreatic necrosis virus in trout IPNV)、神經(jīng)壞死病毒、病毒性出血性敗血癥病毒、鯉春病毒血癥病毒等魚類病毒感染模型，病毒感染方式有體表吸入，腹腔注射等［30］。

利用斑馬魚研究免疫系統(tǒng)的功能有很多優(yōu)點(diǎn)，例如可以檢測(cè)淋巴組織的早期發(fā)育，可以有效進(jìn)行定點(diǎn)突變并對(duì)表型突變株進(jìn)行大規(guī)模篩選。胞漿中的RIG-I樣受體(RLRs)和線粒體中的抗病毒信號(hào)蛋白(MAVS)在抗病毒干擾素的產(chǎn)生過程中有重要意義。魚類細(xì)胞線粒體中也存在與MAVS同源的蛋白，其誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素的機(jī)制與哺乳動(dòng)物細(xì)胞類似［31］。研究MAVS缺失突變的魚細(xì)胞發(fā)現(xiàn)N-端的CARD樣結(jié)構(gòu)域和C-端的跨膜結(jié)構(gòu)域是維持MAVS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能所必需的，而中部富含脯氨酸的區(qū)域是非必需的。

5 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，目前利用小型模式生物對(duì)病毒的研究主要包括：通過闡明模式生物自然病原的感染機(jī)制了解病毒致病的通用途徑;用于動(dòng)物抗病毒機(jī)制的比較學(xué)研究和進(jìn)化研究;以某種基因的插入或缺失突變體作為整體模型，系統(tǒng)地研究基因或蛋白在病毒侵染過程中的作用特點(diǎn);通過表達(dá)轉(zhuǎn)入的病毒基因篩選抗病毒藥物等多個(gè)方面。不同的小型模式生物與人類的親緣關(guān)系差別較大，需要在比較基因組學(xué)和功能學(xué)研究的基礎(chǔ)上進(jìn)行選擇。例如，哺乳動(dòng)物TLRs和節(jié)肢動(dòng)物的Toll家族有明顯差別。前者可直接識(shí)別PAMP，而果蠅的 Toll受體則通過內(nèi)源性蛋白間接地識(shí)別PAMPs;而作為脊椎動(dòng)物的硬骨魚TLR則和與其同源的人類基因產(chǎn)物具有相同的功能［32］。其中，TRL5都是鞭毛蛋白的受體、TRL3能識(shí)別相同的配體且都具有識(shí)別RNA的作用，在抵抗病毒感染的先天性免疫中發(fā)揮重要作用。

合理地選擇小型模式生物，不僅可以在整體動(dòng)物中觀察病毒與宿主的相互作用、彌補(bǔ)細(xì)胞系研究的不足而且能夠較早地進(jìn)行抗病毒藥物的體內(nèi)篩選，降低藥物研發(fā)的成本，有利于縮短研究周期、加快研究進(jìn)度，減少實(shí)驗(yàn)室感染的風(fēng)險(xiǎn)?？傊?，小型模式生物在病毒學(xué)研究中具有廣闊的應(yīng)用前景。

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Application of Small Model Organisms in Research on Viral Mechanisms

SHEN Cong，HE Qi-yang
(Institute of Medical Biotechnology，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100050，China)

Small model organisms such as yeast，nematodes，fruit fly and zebrafish have been widely used in biological research.They are used in research of viral mechanism and led to new understandings of virus-host interaction and antiviral immune mechanisms.The present review summarizes the versatility of these animal models and their main contributions in the elucidation of virus mechanisms.

Model organisms;Virus;Yeast;Nematode;Fruit fly;Zebrafish

R33

A

1671-7856(2011)02-0069-05

10.3969/j.issn.1671.7856.2011.02.16

2010-10-18

科技部“重大新藥創(chuàng)制”綜合性大平臺(tái)項(xiàng)目(2009ZX09301-003)。

沈琮(1985-)，女，博士生，研究方向：微生物與生化藥學(xué)。E-mail：shencyky@163.com。

何琪楊，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：微生物與生化藥學(xué)。E-mail：qyh2000bj@yahoo.com.cn。