小鼠過敏性哮喘模型的研究進展及評價

劉 佳，鄭 健，于 濤

(東北林業(yè)大學(xué)鹽堿地生物資源環(huán)境研究中心，東北油田鹽堿植被恢復(fù)與重建教育部重點實驗室，哈爾濱 150040)

小鼠過敏性哮喘模型的研究進展及評價

劉 佳，鄭 健，于 濤

(東北林業(yè)大學(xué)鹽堿地生物資源環(huán)境研究中心，東北油田鹽堿植被恢復(fù)與重建教育部重點實驗室，哈爾濱 150040)

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是常見的慢性病，隨著過敏患者的增加，小鼠過敏性哮喘模型的研究越來越重要。本文通過對近年來國內(nèi)外小鼠過敏性哮喘的實驗研究文獻進行總結(jié)，從實驗小鼠的選擇、制備模型的方法及模型的評價指標(biāo)等方面進行綜合分析，為進一步開展哮喘研究提供幫助。

哮喘;模型，小鼠;過敏原

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是以氣道高反應(yīng)性(AHR)、黏液高分泌和氣道嗜酸粒細(xì)胞(EOS)、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等多種炎癥細(xì)胞浸潤慢性氣道性疾病。國內(nèi)外已能利用這些特征復(fù)制出哮喘急慢性炎癥和氣道重塑等各種模型。

由于小鼠免疫遺傳背景較為清楚，動物肺功能測定技術(shù)的提高，大量相關(guān)分子生物學(xué)試劑及抗體可供選用，而使得小鼠成為制備哮喘模型的首選動物。本文介紹了幾種小鼠過敏性哮喘模型的制備方法，并總結(jié)了小鼠哮喘模型的評價標(biāo)準(zhǔn)。

1 小鼠品系選擇

實驗小鼠品系很多，常用的品系有 C57BL/6、BALB/c、A/J、CBA、NC/Nga等。其中 C57BL/6 對HDM(屋塵螨)易致敏，可用于制作由HDM誘發(fā)的過敏性哮喘模型，但有文獻指出用塵螨提取液滴鼻激發(fā)NC/Nga小鼠誘發(fā)哮喘模型癥狀強于其他品系小鼠［1］;而 BALB/c易對 OVA(卵白蛋白)和花粉致敏產(chǎn)生 AHR和明顯 lg E超敏反應(yīng)［2］。Jonasson等［3］比較注射與吸入乙酰膽堿在 C57BL/6、BALB/c兩種小鼠體內(nèi)不同影響，發(fā)現(xiàn)在BALB/c小鼠注射比吸入方式肺阻力明顯增強，而在C57BL/6沒有太大差異性。

研究發(fā)現(xiàn)雌性小鼠比雄性小鼠能產(chǎn)生更顯著的過敏性氣道炎癥［4］。Hayashi等研究顯示，在OVA誘發(fā)成熟雌/雄性BALB/c小鼠的遲發(fā)性氣道炎癥中，雄性BALB/c小鼠其嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤的支氣管-細(xì)支氣管炎癥沒有雌性BALB/c小鼠嚴(yán)重，而且支氣管肺泡液中炎癥細(xì)胞數(shù)也較雌性少。由于品系間身體長短和胸圍不同，最終得出的哮喘動物模型也各異。另有研究表明，普通級小鼠可能由于與微生物抗原接觸的機會大大增加，而降低了其對變應(yīng)原哮喘炎癥的敏感性，因而制備哮喘模型不宜用普通級動物［5］。目前，多數(shù)選用6～8周，體重18～22 g的C57BL/6、BALB/c雌性無特定病原體(SPF級)或清潔級小鼠做小鼠哮喘模型。

2 佐劑

佐劑是一種免疫增強劑，本身可以有免疫原性，也可以不具免疫原性。常與抗原物質(zhì)一起注射或預(yù)先注入機體后，影響機體免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，使機體更早、更有效、更持久地產(chǎn)生免疫應(yīng)答。常用的具有免疫原性的佐劑有：百日咳桿菌、結(jié)核分枝桿菌和枯草桿菌等。非免疫原性佐劑有：Al(OH)3(氫氧化鋁)、液態(tài)鋁或明礬等。目前多數(shù)文獻中選用氫氧化鋁作為OVA致敏小鼠哮喘模型作為佐劑，但是實驗中發(fā)現(xiàn)氫氧化鋁與OVA不能很好混合，放置后出現(xiàn)明顯分層;而佐劑與抗原混合的程度會對抗原的免疫原性的產(chǎn)生一定影響。田代印等用硫酸鋁鉀取代氫氧化鋁，并用10 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值，使蛋白質(zhì)變性，兩者形成混懸小球后充分混合，增強了 OVA 的致敏效果［6］。

3 過敏性小鼠哮喘模型的制備

制作過敏性哮喘動物模型的變應(yīng)原主要有OVA、塵螨、豚草、花粉、真菌孢子、蟑螂、蛔蟲卵等。小鼠哮喘模型制作過程分兩階段：致敏與激發(fā)。致敏原的選擇，抗原劑量、致敏和激發(fā)的時間、頻率、方式不同能復(fù)制出不同的哮喘模型。即使相同誘導(dǎo)原致敏激發(fā)方式、間隔時間，持續(xù)時間等亦很難找到完全相同的報道。

3.1 OVA

由于OVA來源容易，價格低廉，而且具有很強的免疫原性，因此是最常用于制備哮喘模型的致敏劑。程曉明等用OVA 10 μg和氫氧化鋁凝膠20 mg的混合液在第1天、第13天腹腔注射致敏BALB/c小鼠，第25天以1%OVA霧化激發(fā)20～30 min，制出急性哮喘模型［7］。最短成模過程包括在第1、8天致敏、第18～21天激發(fā)，需時21 d;經(jīng)典成模過程為在第 1、15 天致敏、第 25 ～29 天激發(fā)，需時 28 d［8］。但這類小鼠模型抗原激發(fā)的時間較短，多不超過1周，此類模型的不足之處在于產(chǎn)生的是缺乏黏膜的慢性炎癥、平滑肌增生、膠原增厚和氣道壁結(jié)構(gòu)改變。因此可通過長時間反復(fù)霧化激發(fā)建立重癥哮喘模型。Maud等在第1、11天用OVA 10 μg和乳化氫氧化鋁凝膠腹腔注射 BALB/c小鼠，第22～96天，用1%的OVA霧化激發(fā)，每周5次每次30 min，建立了小鼠氣道重塑模型，并進一步研究長效土霉素通過調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶及細(xì)胞因子對小鼠氣道重塑模型的作用［9］。

致敏多采用腹腔注射、皮下注射或兩者結(jié)合，越早致敏，越易成模［10］。激發(fā)方式多采用滴鼻激發(fā)或霧化激發(fā)。滴鼻激發(fā)操作方便，無需使用特殊裝置，有人通過一次滴鼻方式成功建立小鼠哮喘模型［11］，但易致死。霧化激發(fā)小鼠狀態(tài)較好，激發(fā)致死率低，但一次不能激發(fā)哮喘模型，需通過多長反復(fù)激發(fā)的方式建立模型。致敏原通過改變劑量影響細(xì)胞因子的類型，進而影響動物模型表型的變化。低劑量抗原進入體內(nèi)，以Th2型細(xì)胞因子分泌為主，引起肺內(nèi)嗜酸粒細(xì)胞聚集、粘液過度分泌等哮喘特征性表現(xiàn)。高劑量的抗原致敏時，誘發(fā)以Th1型細(xì)胞為主的反應(yīng)，抑制了哮喘癥狀的出現(xiàn)。商艷等采用不同劑量(0、10、100、1 000)g的 OVA致敏，反復(fù)激發(fā)后建立哮喘小鼠模型，發(fā)現(xiàn)10 g組出現(xiàn)支氣管哮喘的典型特征，增加致敏的劑量反而減輕了肺部炎癥的程度［12］。

3.2 塵螨和蟑螂

塵螨是我國哮喘患者最常見過敏原之一，50%以上過敏患者和80%以上哮喘兒童對螨蟲過敏原過敏［13］。粉塵螨與屋塵螨都是哮喘患者常見的過敏原。目前，國內(nèi)外主要使用屋塵螨構(gòu)建變態(tài)反應(yīng)性炎癥模型，粉塵螨較少。Tournoy等用不同濃度屋塵螨(3、30、300 μg/mL)連續(xù) 7 d 霧化激發(fā)，發(fā)現(xiàn)300 μg/mL組出現(xiàn) AHR，大量炎癥細(xì)胞浸潤，血清IgE 升高。3 μg/mL 和30 μg/mL組出現(xiàn) AHR，血清IgE 升高，但無氣道炎癥［14］。陳華夏于第 1、3、5、7、9、11天分別腹腔注射 200 μL 含 50 μg粉塵螨蛋白和2.25 mg氫氧化鋁的生理鹽水溶液致敏小鼠：第13、16、19、20 和 21 天分別用 l mL，4 g/L 的粉塵螨提取液反復(fù)霧化激發(fā)，成功建立了肺部變態(tài)反應(yīng)性炎癥模型［15］。Nicholas等［16］研究發(fā)現(xiàn)，使用塵螨、豚草等不同致敏原聯(lián)合作用反復(fù)激發(fā)雌性BALB/c小鼠，建立小鼠氣道重塑模型。另外Narala用蟑螂變應(yīng)原致敏激發(fā) BALB/c小鼠，成功建立哮喘模型［17］。Gore等利用基因重組蟑螂蛋白致敏也成功制作了哮喘模型［18］。

3.3 真菌和花粉

真菌和花粉是引起季節(jié)性哮喘的重要變應(yīng)原，且在環(huán)境中分布廣泛?；ジ艚绘滄呙咕菀字旅簦钦T發(fā)人類哮喘發(fā)作的主要霉菌種類之一。徐用選用C57BL/6小鼠腹腔注射含有4 mg氫氧化鋁的濃度為4×107/mL的孢子懸液50 μL，在第14～17天，取50 μL濃度為4×106/mL的孢子懸液緩慢鼻滴小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠氣道順應(yīng)性降低、反應(yīng)性增高，血清總lgE和抗原特異性IgE升高，炎性細(xì)胞浸潤;免疫反應(yīng)機制上表現(xiàn)為細(xì)胞因子 IL-4升高，INF-γ降低等［19］。

皮下致敏及經(jīng)鼻吸入花粉能誘導(dǎo)小鼠模型產(chǎn)生特異性IgG、IgE抗體、細(xì)胞因子、肺部組織炎癥浸潤、黏液分泌以及非特異性氣道高反應(yīng)性等［20］。

4 小鼠哮喘模型的一般評價指標(biāo)

哮喘模型是氣道高反應(yīng)性和炎癥細(xì)胞浸潤為特征慢性氣道炎癥性疾病，因此，一個理想的哮喘模型應(yīng)從動物的癥狀表現(xiàn)、氣道反應(yīng)性及病理學(xué)改變3個方面來驗證。判斷哮喘模型是否成功和合格至少應(yīng)當(dāng)包括以下4個方面：

4.1 造模后動物總體外觀

小鼠腹腔致敏后出現(xiàn)體重下降，經(jīng)抗原激發(fā)后出現(xiàn)煩躁不安、擦鼻、打噴嚏、呼吸困難或呼吸節(jié)律不整、腹肌抽搐、口唇紫紺伴腹式呼吸、毛發(fā)豎起、反應(yīng)遲鈍等癥狀。

4.2 肺病理切片觀察、炎癥細(xì)胞浸潤、炎性細(xì)胞分類(以EOS為代表)

可進行蘇木精-伊紅(HE)染色、髓鞘堿性蛋白(MBP)染色、剛果紅染色觀察肺組織中炎癥細(xì)胞，尤其是EOS浸潤。A.P.Rogerio等通過蘇木精-伊紅(HE)染色法觀察炎癥細(xì)胞浸潤［21］。何勝東等通過碘酸雪夫(PAS)或阿新藍-過碘酸雪夫(AB-PAS)染色觀察氣道黏液的產(chǎn)生［22］。Masson三色染色主要是觀察膠原沉積。

4.3 BALF中細(xì)胞組分的測定

魏國會等收集BALF液，離心(3 000 r/min)10 min，棄去上清液，沉淀細(xì)胞加0.2 mL緩沖液混懸。吸取0.1 mL于血球計數(shù)板上，顯微鏡下計白細(xì)胞總數(shù);吸取0.01 mL涂片，瑞氏染色后計嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)數(shù)(至少計數(shù)200個細(xì)胞)。也可將BALF通過甩片機制備成細(xì)胞涂片，進行瑞氏-吉姆薩染色或Diff-Quick染色，計數(shù)細(xì)胞總數(shù)并進行分類計數(shù)。

4.4 生理功能指標(biāo)

氣道對各種刺激物的高度敏感狀態(tài)，稱為氣道高反應(yīng)性［24］。目前采用的有離體氣道平滑肌收縮力測定法、有創(chuàng)的肺阻抗或氣道峰壓測定法和無創(chuàng)整體體積描記法。其中整體體積描記法是根據(jù)哮喘時呼氣相時間延長、表現(xiàn)為呼氣末暫停時間延長即為增強的呼氣間歇(enhanced pause，Penh)的現(xiàn)象來定量反映氣流受限程度［25］。該方法優(yōu)點在于可使小鼠在清醒狀態(tài)下測定氣道反應(yīng)性，并通過霧化吸入給予氣道收縮劑，是更接近人類氣道反應(yīng)性測定方法，且操作方法較有創(chuàng)方法簡單。Penh并不是反映氣道阻力的一個直接指標(biāo)，但它與有創(chuàng)條件下測得的氣道阻力、跨肺壓等指標(biāo)有很好的相關(guān)性，且不受小鼠呼吸頻率影響。目前該方法是最被認(rèn)可的小鼠氣道反應(yīng)性測定方法，但有研究認(rèn)為該指標(biāo)也有缺陷，很多情況下不能真正反映氣道反應(yīng)性［26］。

此外，分子水平評價指標(biāo)越來越受到學(xué)者們的重視。通過酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法測定BALF 中細(xì)胞因子(如 IL-4、IL-5、IL-13、IL-10、INF-γ)和血清總lgE、抗原特異 IgE含量測定，使人們對小鼠哮喘模型機理有了更加深入的了解。Won-Kyo Jung等末次激發(fā)24 h后，處死小鼠離心肺泡灌洗液，取上清液通過 ELISA 測定 IL-4、IL-5、IFN-γ、and、TNF-α含量［27］。蘇新明等通過測定血清總 IgE和OVA特異性IgE水平檢測是否成功建立小鼠哮喘模型［28］。

綜上所述，小鼠哮喘模型的建立受到多因素如遺傳背景、佐劑的選擇、致敏原的劑量與時間的控制，人們可根據(jù)自己要求建立不同的哮喘模型。但對模型建立的標(biāo)準(zhǔn)至今沒有量化，只是根據(jù)對哮喘本質(zhì)的認(rèn)識而評價出至少要有氣道高反應(yīng)性和炎癥細(xì)胞浸潤這兩大特征。此外，雖然小鼠哮喘模型在哮喘發(fā)病機理及新藥的研發(fā)中發(fā)揮重大作用，但仍具有一定的弊端：一方面人類器官遠比小鼠器官復(fù)雜得多，很多實驗結(jié)果表明，人類哮喘和小鼠哮喘模型在許多方面如血漿蛋白滲出等有很大差異;另一方面，小鼠哮喘模型是在實驗室中通過人為刺激建立，與人類實際的哮喘發(fā)病情況有不同。

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Progress and Evaluation of Research on Mouse Models of Allergic Asthma

LIU Jia，ZHENG Jian，YU Tao
(Alkali Soil Natural Environmental Science Center，Northeast Forestry University/Key Laboratory of Saline-alkali Vegetation Ecology Restoration in Oil Field，Ministry of Education，Harbin 150040，China)

Bronchial asthma(asthma for short)is a common chronic disease.With the increase of allergic patients，it is increasingly important to emphasize the need of mouse allergic asthma models in research of this disease.This review summarizes recent domestic and overseas literatures on mouse allergic asthma experiments through comprehensive analysis on mouse selection，models making and model evaluation.

Asthma;Model，Mice;Allergen

R562.2+5;R33

A

1671-7856(2011)02-0065-04

10.3969/j.issn.1671.7856.2011.02.15

2010-09-16

劉佳(1981-)，女，碩士研究生，細(xì)胞生物學(xué)專業(yè)，E-mail：hlelj@sina.com。

于濤(1969-)，男，講師，從事生物化學(xué)方向研究，E-mail：yangwang0815@126.com。